RP-HPLC法测定皱叶凤毛菊中3种有效成分

2011-05-25吉守祥贾丽红卢永昌

中成药 2011年4期

王欢，吉守祥，贾丽红，卢永昌

（青海民族大学化学与生命科学学院青海西宁 810007）

皱叶凤毛菊Saussurea malitiosaMaxim.为菊科植物，生于灌丛中、砂质山坡，海拔3 000～4 300 m［1］，为藏医常用草药。皱叶凤毛菊味苦，性凉，无毒，具有止血清热等功效［2］，治疗疮伤流血，解肉食中毒，清脉热、血热。全草入药治中毒性热症及骨折、风湿性筋骨痛［3］。芦丁能维持毛细血管抵抗力、降低其通透性及脆性，还有抗炎、利尿、抗过敏、降血脂等作用，是医药工业中制备羟乙芦丁、芦丁片、曲克芦丁等药的主要原料［4］;木犀草素具有清热、解毒、消炎的作用，是用于治疗炎症疾病的有效成分［5-6］，国内外主要集中在对人体黑素瘤细胞的保护作用、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肝细胞生长因子等方面［7-9］进行开发研究。异鼠李素具有抗癌、抗心肌缺血缺氧、抗心律失常、降胆固醇、止咳祛痰、消食化滞、活血散瘀、抑制心肌细胞凋亡［10-12］等作用，主要治疗咳嗽痰多、消化不良、食积腹痛、瘀血经闭等疾病。本试验利用HPLC测定了皱叶凤毛菊中3种有效成分，旨在为合理利用和开发这一植物的药理活性提供科学的理论依据。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

Agilent1200高效液相色谱系统（Agilent公司）、Eclipse XOB-C18（4.6 mm ×150 mm，5 μm）色谱柱、KQ3200 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、电子天平（赛多利斯ME215S）。

芦丁（10080-200306）、木犀草素（111520-200201）、异鼠李素（110860-200406）均购自中国药品生物制品检定所;甲醇（色谱纯，山东禹王实业有限公司禹城化工厂）;水（娃哈哈纯净水，杭州娃哈哈百立食品有限公司）;磷酸为AR级（北京红星化工厂）。

皱叶凤毛菊于2008年8月采于青海省互助北山林场，由中国科学院西北高原生物研究所孙洪发研究员鉴定，样品阴干后，冷藏保存。

1.2 方法与结果

1.2.1 色谱条件色谱柱:Eclipse XOB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）;流动相∶甲醇和水（含0.04%磷酸）以0～12 min，44% ～44%甲醇，体积流量为1 mL/min;20～25 min，56% ～66%甲醇，体积流量0.5 mL/min的梯度洗脱;检测波长为360 nm;柱温:30℃。该色谱条件下芦丁、木犀草素、异鼠李素3种成分均被洗脱且达到基线分离，见图1。

1.2.2 对照品溶液的配置分别精密称取适量的芦丁、木犀草素、异鼠李素对照品，用甲醇溶解，于5 mL的量瓶中定容，摇匀作对照品溶液备用。

1.2.3 供试品溶液精密称取皱叶凤毛菊样品2.0 g，加入甲醇10 mL，超声提取35 min，过滤，用滤渣重复上述操作2次，将3次提取的滤液合并，定容于50 mL量瓶中。过0.45 μm滤膜，将滤液作为供试品溶液备用。

1.2.4 线性关系考察分别精密量取适量3种对照品贮备液混合，得混合对照品标液。并吸取10 μL进样，按上述色谱条件进行测定，各组分进样量（μg）与峰面积A进行线性回归，结果见表1。

图1 3种对照品（A）和皱叶凤毛菊提取物（B）色谱图

1.2.5 检测限在以上色谱条件下，当信噪比S/N=3时，测定各组分，测得芦丁、木犀草素、异鼠李素的最低检测限分别为0.23、0.36和0.32 ng。

1.2.6 精密度试验取上述混合对照品溶液10 μL进样，重复进样5次，记录色谱峰的峰面积，得3种活性成分的峰面积RSD分别为0.92%，0.86%和1.1%（n=5），表明仪器精密度良好。

1.2.7 稳定性试验取上述的供试品溶液，在选定的色谱条件下，连续3 d进样，记录芦丁、木犀草素、异鼠李素的峰面积，得峰面积RSD分别为1.5%，1.1%和1.8%（n=3），表明供试品溶液在3 d内稳定。

1.2.8 重复性试验精密称取测试样品粉末5份，按1.2.3项下的方法，制备成供试品溶液。按1.2.1项下的色谱条件，进样并记录峰面积，计算各组分的量，得芦丁、木犀草素、异鼠李素的质量分数RSD分别为0.98%、0.95%和1.56%（n=5）。

1.2.9 回收率试验称取已知量的皱叶凤毛菊5份各约2.0 g，分别加入一定量的混合对照品溶液，制备成供试品溶液（同1.2.3项），按上述的色谱条件进行测定，芦丁、木犀草素、异鼠李素的平均回收率，见表2。

1.2.10 样品测定精密称取测试样品约2.0 g，制备样品溶液（同1.2.3项），在选定的色谱条件下进样，经DAD检测器检测上述3种待测组分的峰纯度且其紫外光谱与对照品一致后，按外标法以峰面积积分值计算，结果见表3。

2 讨论

2.1 检测波长的确定将芦丁、木犀草素和异鼠李素对照品溶液经DAD检测器在紫外区域进行检测，结果发现在254 nm、274 nm、320 nm及360 nm均有吸收。而在360 nm处其他组分吸收较少，3种成分紫外吸收良好，有利于测定，故选择360 nm作为其检测波长。

2.2 提取方法确定通过试验，分别测试了甲醇、乙醇回流提取和甲醇、乙醇超声提取等条件下的提取率，结果证明用甲醇超声提取时提取率较高。

2.3 流动相的选择在筛选黄酮苷类活性成分测定的色谱条件过程中，由于3种成分很难达到基线分离，曾尝试过用不同比例的甲醇和水及乙腈和水作为的流动相，由于乙腈成本较高，故选用甲醇和水作为流动相，最终发现甲醇-水（0.04%磷酸）为0～12 min，44% ～44%甲醇，体积流量为1 mL/min;20～25 min，56% ～66%甲醇，体积流量0.5 mL/min的梯度时，3种活性成分均被洗脱且达到基线分离。在色谱图中出现了前面峰宽，后面峰窄的现象，可能是由于流动相中溶剂的比例不同而导致。