HPLC-ESI-MSn法测定黄芪药材中黄芪甲苷

李 晶， 韦露莎， 申旭霁， 赵新锋， 王世祥， 郑晓晖，2*

（1.西北大学生命科学学院，陕西西安 710069;2.西北大学与深圳清华大学研究院共建“创新中药及天然药物研究”联合实验室，广东深圳 518057）

黄芪是豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，是中医临床广泛用于补气固表和托毒排脓的药材之一［1］。黄芪含皂苷、黄酮、多糖及氨基酸等多种化学成分，黄芪皂苷为黄芪的主要活性成分，并以黄芪甲苷为主［2］。目前，有关黄芪甲苷的测定方法包括高效液相色谱-蒸发光散射检测法，高效液相色谱-紫外检测法，薄层扫描法［3-5］。上述方法对黄芪药材及其制剂中黄芪甲苷的测定有重要意义，且有潜在的推广应用前景。然而，由于黄芪甲苷为紫外末端吸收物质，其在复杂体系中高效测定方法的建立仍然是需进一步研究的问题之一。本试验建立了黄芪醇提物中黄芪甲苷的高效液相色谱-电喷雾-离子阱（HPLC-ESI-MSn）测定方法，旨在为复杂体系中黄芪甲苷的快速测定提供方法。

1 仪器与试药

仪器:Agilent1100系列高效液相色谱-电喷雾-离子阱质谱联用仪，包括二元梯度泵、二极管阵列检测器、电喷雾离子源、SL型离子阱质谱和Chemistation 5.2工作站。

材料及试剂:黄芪（购于西安藻露堂药店，经西安市药品检验所鉴定）;黄芪甲苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号:110781-200613）;色谱纯甲醇（美国Fisher公司）;实验用水为超纯蒸馏水（自制）;其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 分析条件

色谱条件:色谱柱为 Agilent SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相为甲醇-0.2% 甲酸水（70 ∶30，v∶v）;体积流量为0.7 mL/min;检测波长为203 nm;柱后2:1分流，三分之一流出液进行质谱分析。

质谱条件:电喷雾正离子模式检测;雾化气压力为35.0 psi;干燥气温度为350℃，流速为8.0 L/min;黄芪甲苷选择离子对为m/z807.4→627.2;质量扫描范围为100～1 000 amu。该条件下，黄芪药材中黄芪甲苷提取离子流图和质谱图分别见图1和图2。

2.2 供试品溶液的制备 黄芪甲苷对照品溶液的制备:精密称取黄芪甲苷标准品5.2 mg，甲醇溶解于5.0 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，制备成浓度为1.04 mg/mL的对照品溶液。

图1 黄芪甲苷提取离子流图

黄芪药材供试品溶液的制备:取黄芪药材20.0 g，50.0℃干燥至恒重。粉碎，过40目筛，准确称取药材粉末5.0 g，置具塞锥形瓶中，加10倍量甲醇，冷浸过夜，超声提取3次，每次30 min，滤过，合并滤液，减压浓缩至干，残渣用甲醇溶解至10.0 mL量瓶中，加甲醇至刻度，4.0℃冷藏备用［6］。

2.3 线性关系考察 精密吸取2.2项下对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL，用甲醇稀释并定容到 1.0 mL 量瓶中，制备系列质量浓度对照品溶液。在拟定分析条件下，准确吸取10.0 μL进样分析。黄芪甲苷离子选择m/z807.4为母离子，627.2为子离子，测定提取离子流图峰面积［7-8］。以质量浓度为横坐标，以提取离子流图峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程为:Y=379.18X+9.052 1（r=0.999 7），提示黄芪甲苷在0.10～1.04 mg/mL范围内线性关系良好。以3倍信噪比为标准，测得黄芪甲苷的最低检测限为5 ng/mL（S/N=3）。

图2 黄芪甲苷质谱图

2.4 精密度实验 在拟定分析条件下，精密吸取黄芪药材供试品溶液10.0 μL，连续进样5次，记录提取离子流图峰面积，测定黄芪甲苷量，计算得相对标准偏差（RSD）为2.7%，提示该方法具有较好的精密度。

2.5 重复性实验 取同一黄芪样品5份，按2.2项下方法制备供试品溶液，在拟定分析条件下，准确吸取10.0 μL进样分析，测定黄芪甲苷量，计算得RSD为3.2%，提示该方法重复性良好。

2.6 稳定性实验 取黄芪药材供试品溶液，分别在0、4、8、16、24 h和36 h后，在拟定分析条件下，准确吸取10.0 μL进样分析，测定黄芪甲苷量，计算得RSD为2.4%，提示黄芪供试品溶液在36 h内稳定性良好。

2.7 加样回收率实验 精密称取5份黄芪甲苷量已知的黄芪药材，每份5.0 g，分别准确加入浓度为1.04 mg/mL黄芪甲苷对照品溶液2.0 mL，按2.2项下方法制备供试品溶液。在拟定分析条件下，准确吸取10.0 μL进样分析，测定黄芪甲苷量，结果见表1。由表1可见，方法平均回收率为96.51%，表明该方法具有较好的回收率。

表1 加样回收率实验结果 （n=5）

2.8 样品测定 分别精密称取黄芪药材3份，每份5.0 g，按2.2项下方法制备供试品溶液。在拟定分析条件下，准确吸取10.0 μL进样分析，测定黄芪甲苷质量分数。结果表明，供试药材中黄芪甲苷的平均质量分数为0.54 mg/g。

3 讨论

3.1 黄芪甲苷为末端紫外吸收物质［9］，采用紫外检测法进行测定，一般具有灵敏度差等不足。蒸发光散射检测器虽然能用于黄芪甲苷等紫外末端吸收物质的测定，但线性范围一般低于3个数量级，且在灵敏度方面与紫外相比并未显示出独特的优势。质谱法以气态离子为检测对象，检测灵敏度不受待测对象紫外光吸收性质的限制，在紫外末端吸收物质的测定方面具有独特的优势。因此，本试验以质谱法为手段，进行黄芪药材中黄芪甲苷的测定。

3.2 本试验采用多级反应模式即选择离子对法进行黄芪甲苷的测定。该方法以黄芪甲苷的准分子离子m/z807.4和二级碎片离子m/z627.2为离子对对药材中的黄芪甲苷进行定性，具有特异性强的特点。此外，由于选择离子对法能有效排除复杂体系中的基质对待测对象的干扰，因此不仅能有效缩短分析时间，而且灵敏度高。综上，本试验所建立的黄芪药材中黄芪甲苷的测定方法，具有灵敏度高，重现性好和快速的特点，可用于黄芪药材的质量评价，而且有望为生物样品等复杂体系中黄芪甲苷的快速测定提供方法。

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