高效液相色谱法优选四味中药的提取方法

容 蓉， 邱丽丽， 吕青涛， 蒋海强， 王 薇， 李 峰

（1.山东中医药大学，山东济南 250355;2.胜利油田中心医院，山东东营 257000）

中药寒、热、温、凉的药性是其所含成分作用于机体的客观反映，是区别于植物药和天然药的重要标志［1］。自上世纪70年代以来，很多学者对中药四性的物质基础进行了探索研究，但哪些成分起寒凉作用、哪些起温热作用，药性是中药单一成分的作用、还是多种成分的综合表现，尚须深入研究［2］。在总结近40年研究工作的基础上，欧阳兵等提出“组群中药四性组合性效谱”假说，认为中药的起效机制是整体调节，中药调治寒热二证的物质基础应是组成中药的所有化学成分的整体协同作用［3］。

通过测定寒性、热性中药的HPLC图谱，尽可能获得其化学成分的整体信息，将有助于比较其物质基础的共性和差异。本实验选取药性明确的二味寒性中药（蒲公英、金银花）和二味热性中药（干姜、仙茅），采用HPLC法测定，以未知成分的HPLC特征峰数据（总色谱峰数量和总色谱峰面积）为指标，通过正交试验优选这四味中药的提取方法，为后续的以HPLC图谱表征寒性、热性中药的物质信息奠定基础。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪（DAD检测器，二元高压梯度泵，柱温箱;美国安捷伦公司）;KQ-250E型医用超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司）;Mettler AE 240电子天平（瑞士梅特勒公司）。

蒲公英Taraxacum mongolicumHand.Mazz.、金银花Lon-icera japonicaThunb.药材购自山东省临沂市，干姜Zingiber officinaleRosc.、仙茅Curculigo orchioidesGaertn.药材分别购自四川省犍为市和宜宾市，经山东中医药大学药学院李峰教授鉴定，均为道地药材;乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司）;水为娃哈哈纯净水;其它试剂均为分析纯（天津科密欧化学试剂开发中心）。

2 方法与结果

2.1 提取方法的正交试验设计 本实验对粉碎粒度（A）、提取时间（B）、提取温度（C）、甲醇浓度（D）等对提取效果影响较大的因素，通过正交试验设计进行考察，结果见表1。

表1 正交试验因素水平

2.2 供试药液的制备 分别取二味寒性中药-蒲公英（1#）、金银花（2#）、二味热性中药-干姜（3#）、仙茅（4#）粉末0.5 g各9份，按照表1设计的因素水平进行L9（34）试验，试验样品编号见表2、表3，超声提取，提取完毕，放至室温，再次称定质量，用相应浓度的甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为HPLC供试药液。

2.3 HPLC图谱色谱条件的建立 色谱柱:Agilent XDB-C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）;流动相:乙腈-水（3 ∶97）→乙腈-水（100∶0），90 min，线性梯度洗脱;体积流量:1.0 mL/min;进样量:20 μL;柱温:35℃。检测波长分别为1#:366 nm、2#:236 nm、3#:220 nm、4#:206 nm。

表2 二味寒性中药正交试验结果

表3 二味热性中药正交试验结果

2.4 指标数据标准化处理 以各药材供试液在相应波长下的色谱峰总数量（total peak number，简称TPN）和色谱峰总面积（total peak area，简称TPA）为考察指标。因各指标变量单位和量纲不同且变量范围相差悬殊，对不同性质指标直接加和不能正确反映不同作用力的综合结果，故对这两组数据按照公式（1）进行标准化处理;将标准化后的各指标数据求和，即得综合评价值Y，寒性和热性中药样品试验结果分别见表2、表3。

xi，j为第i个样品的指标j的测定值，j为1-9号样品指标j的平均测定值，x′i，j为第i个样品的指标j的标准化数据。

2.5 正交试验结果分析 正交试验的极差分析结果见表2、表3。直观分析结果表明，四味中药皆以因素D（甲醇浓度）为主要影响因素，通过直观分析优选各药味的最佳提取条件见表4。

表4 正交试验优选结果

在正交设计中，如果没有重复试验，又无空白项时，常取其中离均差平方和最小的因素项作为误差估计，用以检验其他因素作用的显著性［4］。本实验采用SPSS11.5软件对表2、表3中的正交试验结果进行方差分析［5］。首先不考虑试验误差，将A、B、C、D四个因素都作为处理因素，进行分析;根据分析结果，取各组数据分析结果中SS最小的因素作为误差估计，检验其它因素作用的显著性，再次进行统计分析，结果见表5。

表5 正交试验数据方差分析

经方差分析可知，因素D（甲醇浓度）对4种中药的提取效率均有显著性影响，因素A（粉碎粒度）、B（提取时间）、C（提取温度）对各味中药的提取效率作用不显著。为了统一提取方法，以便平行比较寒性、热性中药物质基础的差异，综合考虑各因素的影响，确定以A2B2C3对寒性、热性中药进行提取。从表4可知，二味寒性中药的最佳提取溶剂为50%甲醇。热性中药仙茅为70%甲醇;干姜虽为90%甲醇，但与70%甲醇提取效率相差不大。为了使提取液尽可能地反映寒性、热性中药物质基础信息，同时保证提取方法的一致性，确定同时用50%甲醇和70%甲醇两种溶剂对2味寒性、2味热性中药进行平行提取。综上，4味中药的最佳提取条件为:40目药材粉末，平行采用50%和70%的甲醇，60℃水浴超声提取30 min。

2.6 验证试验 按照以上确定的最佳提取条件，对4味中药分别平行提取3批，测定其HPLC图谱，计算其HPLC特征峰TPN和TPA，将其与正交试验结果数据合并后进行标准化处理，计算综合评价值Y，发现验证试验综合值Y均优于正交试验的各次测定结果，见表6，证明该方法稳定、可靠。

表6 验证试验结果

3 讨论

3.1 关于药性作用物质基础的研究，若偏重于单一或几种已知成分，将无法对其从整体上进行把握。刘培勋等提出“中药药性物组学”观点［6］，建议采用现代色谱、光谱技术，获取中药全化学成分的物质组信息，以期阐明中药药性理论的本质。针对不同药性的中药进行分析、测定，获取其尽可能全面的化学成分信息，进而通过数据分析和信息挖掘，寻找寒性、热性中药化学信息的共性规律，可以有助于最终阐明寒性、热性中药药性、药效及物质基础的相关性。本实验通过建立HPLC图谱尽可能反映中药的整体化学信息，对2味寒性、2味热性中药的提取方法进行了优化。

3.2 实验过程中，首先比较了回流提取与超声提取的优劣，发现超声提取的效率较高;其次分别对粉碎粒度、提取时间、提取温度、甲醇浓度进行单因素考察，发现粒度过细、时间过长、温度过高对于提取效果并没有太大影响;同时，当甲醇浓度过低时（30%、40%），并不能提高提取液中色谱峰的数目和峰面积，反而会因甲醇浓度过低，提取液中多糖含量增加，不利于HPLC分析;据此设定了各因素的水平。

3.3 建立中药药性指纹图谱，将有助于实现指纹图谱特征和药性相关性研究［7］。本实验在提取效率的评定指标选取方面，基于中药部分成分已知、大部分成分未知的现实，本实验在构建供试药液HPLC图谱的基础上，以其总色谱峰数量和总色谱峰面积为指标，尝试针对未知结构的多成分的模糊数据进行统计分析，优选寒性、热性中药的共性提取方法，较以往更加注重多种成分的群体效应，为通过HPLC图谱寻找不同药性中药物质信息的共性规律奠定基础。

3.4 由于每味中药所含成分各不相同，若HPLC分析时采用相同检测波长难免会有失偏颇，故本实验采用二极管阵列检测器对样品进行全波长检测，以色谱峰数量和色谱峰总面积为指标，通过对光谱等势图的分析，优选了对各味中药供试液检测灵敏度最高的检测波长。

［1］邓家刚，秦华珍，秦海洸.中药药性效应及物质基础的文献研究［J］.河南中医，2007，27（5）:82-84.

［2］余惠旻，周红祖，肖小河，等.中药四性的研究进展与展望［J］.中国中医基础医学杂志，2001，7（8）:621-624.

［3］欧阳兵，王振国，王 鹏，等.“组群中药四性组合性效谱”假说及其论证［J］.山东中医杂志，2006，25（3）:153-156.

［4］张春华，严云良主编.医药数理统计［M］.北京:科学出版社，2001:212.

［5］胡志洁.SPSS 11.5软件在正交试验设计中的应用［J］.医学信息，2007，20（5）:737-740.

［6］刘培勋，龙 伟.中药药性与中药药性物组学［J］.中国中药杂志，2008，33（14）:1769-1771.

［7］雷钧涛，孙晓华，张笑波，等.基于理化指纹图谱信息提取及模式识别的中药药性理论研究方法［J］.辽宁中医杂志，2010，37（2）:317-318.