透明质酸凝胶中肌源性干细胞与透明软骨联合培养的实验研究

沈兆亮，梅晰凡，袁亚江，李全双，郭占鹏，张赫

（辽宁医学院附属第一医院骨科，辽宁 锦州 121000）

目前促进肌源性干细胞（muscle-derived stem cells，MDSCs）向软骨定向分化的主要方法是应用胰岛素样生长因子、转化生长因子2［1］和骨形态发生蛋白2［2］等诱导因子进行诱导。但因为价格昂贵、用量大、剂量不易控制、内环境会对诱导细胞产生影响等因素，使其在成软骨方面受到极大的限制［3］。为进一步探索MDSCs在成软骨细胞的过程中，软骨细胞分泌的细胞外基质所起的作用，扩大和优化成软骨的种子细胞。本研究采用MDSCs与软骨细胞联合培养的方法，以透明质酸凝胶作为载体，使MDSCs向软骨样细胞分化，研究MDSCs在体外模拟软骨微环境内向软骨样细胞转化的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

新生新西兰兔2只，雌雄不限，体质量（150±20）g，由辽宁医学院实验动物中心提供（动物质量许可号：SCXK（辽）2003－2007）。胎牛血清（购自杭州四季青生物工程材料有限公司）；DMEM、胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶（购自GIBCO公司）；Ⅱ型分散酶（购自Sigma公司）；鼠抗兔desmin、SABC试剂盒（购自武汉博士德生物工程有限公司）；透明质酸凝胶（购自山东博士伦福瑞达制药有限公司）；鼠抗兔Ⅱ型胶原多克隆抗体、PV9000（购自北京博奥森生物有限公司）；RT-PCR试剂盒（购自上海生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 兔MDSCs的分离培养：肌源性干细胞的分离培养参考Blanco-Bose等［3］的方法，取1 d龄新西兰大耳白兔1只，无菌条件下取其四肢骨骼肌，剪成乳糜状，加入2倍体积混合酶（2.4%的Ⅱ型分散酶，1%Ⅱ型胶原酶，2.5 mmol/L的CaCl2），每15 min吹1次，消化1 h。终止消化后过滤，离心后用含15%胎牛血清的培养基重新悬浮细胞，培养记为PP1。2 h后采用差速贴壁法吸取上清液接种于另一培养瓶中，记为PP2。24 h后离心重悬后接种到新的培养瓶，记为PP3，每24 h运用差速贴壁法直至获得PP6，置于细胞培养孵箱中培养，扩增。

1.2.2 兔MDSCs的鉴定：第4代MDSCs种植到6孔板中的盖玻片上，加入含5%透明质酸凝胶的培养基培养，第5天细胞生长达70%～80%汇合，10%福尔马林固定30 min，PBS洗3次，每次2 min。30%H2O 21份+纯甲醇9份混合，室温浸泡15 min，蒸馏水洗3次。0.1%的Triton X-100，室温浸泡30 min，PBS洗3次。滴加3%BSA封闭液，室温30 min，甩去多余液体，不洗。滴加鼠抗兔Desmin一抗（1∶100），4℃过夜，PBS洗 3次，每次 5 min；滴加生物素化二抗 IgG，37℃，20 min，PBS洗 2次，每次 5 min；加ABC复合物室温作用15 min，PBS洗3次，每次5 min；DAB显色10 min。逐级乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片，显微镜下观察，照相。

1.2.3 兔软骨细胞的分离与培养：新生1 d龄新西兰大耳白兔于耳缘静脉注射空气处死。无菌条件下取关节表面软骨，PBS（含青、链霉素各100 U/ml）冲洗2次，眼科剪剪碎，加入混合酶（100 ml含有Ⅱ型胶原酶 0.2 g，Ⅱ型分散酶 0.48 g，CaCl20.028 g）消化3 h，中间每30min充分吹打1次，加入相同体积的DMEM（含15%胎牛血清）终止消化，过滤，1 000 r/min离心10 min后完全培养基重悬细胞，将细胞接种于25 ml的培养瓶中培养记为R1，37℃、5%CO2培养。

1.2.4 肌源性干细胞与软骨细胞的共同培养：第4代MDSCs达到50%融合时，胰蛋白酶消化，800 r/min离心5 min，重悬后与软骨细胞以（3∶1）的比例，6×1010/L细胞密度接种于25 ml培养瓶中作为共同培养组；以相同密度的单纯MDSCs作为阴性对照组；以相同密度的单纯软骨细胞作为阳性对照组；加入含有5%透明质酸凝胶的培养液中进行悬浮培养。分别于3、5、10 d将悬浮液离心收集细胞，以1.5×104/cm2细胞密度接种于预置了盖玻片的6孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM液培养过夜。第2天细胞贴壁后取出玻片，用10%福尔马林固定玻片，进行甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学检测。

1.2.5 甲苯胺蓝染色：将1 g甲苯胺蓝溶于100 ml PBS中配成1%甲苯胺蓝溶液。将各组的玻片用10%福尔马林固定1 h，PBS洗3次，每次5 min，甲苯胺蓝染色1 h，75%乙醇冲洗1次，90%乙醇冲洗1次，95%乙醇冲洗1次，蒸馏水冲洗1次，光镜下观察照相。

1.2.6 Ⅱ型胶原免疫组织化学和分化率测定：将各组3、5、10 d的细胞玻片用10%福尔马林固定1 h，PBS洗涤，行SABC免疫细胞化学显色。使用兔抗鼠一抗和鼠抗兔FITC二抗，直接参照SABC试剂盒操作方法进行显色。以软骨细胞作为阳性对照，MDSCs作为阴性对照组进行检测。随机选取10个视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞数目，算出分化率。

1.2.7 RT-PCR检测ColⅡ和aggrecan mRNA的表达：采用RT-PCR检测MDSCs经诱导后ColⅡ和aggrecan mRNA的表达；ColⅡ 上游引物5′-CACCCATGGACATTGGAGG-3′，下游引物 5′-AGCCCCGCACGGTCTTGCTT-3′，323 bp；aggrecan 上游引物 5′-GAGGAGATGGAGGGTGAGGTCTTT-3′，下游引物5′-CTTCGCCTGTGTAGCAGATG-3′，313 bp。

进行RT-PCR扩增，PCR条件为ColⅡ：94℃，3 min；94 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72℃30 s；72 ℃，5 min；30个循环。aggrecan：94℃，3；94 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72℃，30 s；72℃，5 min；30个循环。其产物用 10 g/L琼脂糖检测扩增结果。

1.2.8 统计学处理：采用SPSS13．0统计软件进行处理分析，数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 兔MDSCs的Desmin鉴定

肌源性干细胞本身具有特征性的外形，其胞质中含有结蛋白（Desmin）可通过细胞免疫组织化学方法鉴定。本实验采用小鼠抗兔Desmin抗体对肌源性干细胞进行鉴定，细胞质Desmin染色阳性，随机观察500个细胞，90%为Desmin阳性。

2.2 细胞形态观察

共同培养组肌源性干细胞的形态学变化，悬浮培养细胞呈小圆型，从第3天将细胞收集贴壁在倒置相差显微镜下观察，细胞较贴壁培养的细胞小，立体感强，细胞形态部分变为多边角形，并带有凸起。第10天时大部分MDSCs转化为多边角形，而阴性对照组细胞依然保持着长梭形，阳性对照组细胞呈多边角形。

2.3 共同培养后肌源性干细胞软骨特异性物质表达检测

共同培养组细胞与阳性对照组相同，甲苯胺蓝染色显示异染性，细胞内、外的某些物质染成紫红色，而阴性对照组中细胞染为蓝色，形态为长梭形（图1）。共同培养组细胞与阳性对照组Ⅱ型胶原免疫细胞化学可见较多胞质发出比较明亮绿色荧光的阳性细胞，而阴性对照组中未见Ⅱ型胶原阳性细胞（图3）。

图1 共同培养组细胞甲苯胺蓝染色阳性 ×100Fig.1 Positive toluidine blue staining in co-culture group×100

图2 共同培养组Ⅱ型胶原免疫荧光检测可见较强的荧光，Ⅱ型胶原表达较强，细胞形态多为多边形 ×400Fig.2 Strongly positive expression of collagen typeⅡand polygonal-shaped cells in co-culture group detected by immunofluorescence×400

2.4 肌源性干细胞分化后的分化率测定

MDSCs在诱导分化的过程中，第3天Ⅱ型胶原检测开始出现阳性细胞，量极少；第5天出现较多阳性细胞，10 d将近80%细胞呈阳性反应。试验组和对照组比较均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.5 RT-PCR

各组细胞经RT-PCR扩增后，共同培养组和阳性对照组可见Ⅱ型胶原和aggrecan的表达，说明经诱导的细胞中表达Ⅱ型胶原和aggrecan的mRNA，而阴性对照组中未见表达（图3）。

表1 M D S C s诱导分化率（%）（x±s，n=10）T ab.1 R ate of M D S C s differentiation（%）（x±s，n=10）

图3 C olⅡ和聚焦蛋白聚糖m RNA表达的RT-P C R检测Fig.3 Expressions of colⅡand proteoglycan m RNA detected by RT-P C R

3 讨论

随着细胞生物学、生物材料科学、工程学以及相关物理、化学学科的发展，各种新的关节软骨缺损修复方法逐渐被研发应用。组织工程学的兴起为关节软骨修复提供了新的选择。近年来软骨组织工程的研究热点之一就是种子细胞的选择，目前研究较广泛的种子细胞包括：自体软骨细胞［4］、异体软骨细胞［5］、胚胎干细胞［6］、骨髓基质细胞［7］、脂肪干细胞［8］等，其中也包括来源于中胚层的肌源性干细胞，肌源性干细胞位于骨骼肌肌纤维膜外，属于多能干细胞［9，10］，具有多细胞系分化和自我更新能力。肌源性干细胞具有低黏附的重要特性，成纤维细胞、内皮细胞的贴壁能力强于卫星细胞，卫星细胞的贴附能力又强于肌源性干细胞，因而preplate差速贴壁技术已经成为肌源性干细胞的重要分离技术［11］。

透明质酸（HA）［12］是一种线形黏多糖是关节液和软骨基质重要组成成分，无种族特异性。透明质酸具有高度水化的性能，在对组织内部的水分平衡、关节的润滑以及稳定软骨基质等方面发挥了重要的作用。高纯度的透明质酸免疫原性低，生物相容性好，而且透明质酸在体内可被血清中的透明质酸酶所降解。关节液含有一定浓度的HA，正常浓度和属性的HA对维持关节功能起重要作用，它能与糖蛋白结合附着于关节软骨表面，起分子筛和保护膜作用；与蛋白质结合游离于关节液中，起润滑作用，减少运动过程中软组织和关节面间的相互摩擦。在应力作用下，HA可使关节液由流动体转为弹性体，减少关节承受压力，从而保护关节软骨。Petrella等［13］研究发现在急性扭伤踝关节注射透明质酸可以减轻疼痛，缩短治愈时间，并且明显减少踝关节再伤的机会。本实验以透明质酸凝胶为载体，对软骨细胞和肌源性干细胞进行混合三维培养，细胞活性不但未受影响，而且保持了软骨细胞的特性，未观察到软骨细胞有老化现象。

本实验应用软骨细胞和肌源性干细胞于透明质酸凝胶中联合培养，在第3天时，细胞没有明显变化，第5天时贴壁细胞形态类似软骨细胞形态增多。10 d后大部分贴壁形态为典型软骨细胞形态。对实验组行甲苯胺蓝染色，结果出现大部分红染的阳性细胞，阴性对照组细胞染色为蓝色。提示共同培养组细胞能够分泌软骨细胞特异性蛋白多糖，同时进行Ⅱ型胶原免疫组化显示共同培养组细胞分泌基质中也含有Ⅱ型胶原成分，阴性对照组则没有表达。RT-PCR检测细胞的colⅡ和aggrecan mRNA的表达，结果提示共同培养组的colⅡ和aggrecan mRNA表达阳性。进一步证实诱导组的MDSCs已向软骨细胞转化，研究发现软骨细胞培养液可以诱导MDSCs分化为软骨样细胞，但是，MDSCs分化为软骨样细胞的具体机制，还需要进一步研究。

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