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发育中大鼠咬肌乙酰胆碱酯酶含量的变化及功能负荷对其影响*

2011-05-24马军利王冠超鄂玲玲刘洪臣

中华老年口腔医学杂志 2011年1期
关键词:终板酯酶肌纤维

马军利 顾 斌 王冠超 鄂玲玲 刘洪臣

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AchE)是一种具有乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)降解活性的酶,广泛分布于骨骼肌、中枢、外周神经系统、以及胆碱能神经元支配的内、外分泌腺、平滑肌、心肌等组织,大量聚集于神经肌肉接头,是神经肌肉接头重要组成部分。神经冲动刺激神经末梢释放大量的Ach,与突触后nAch受体结合,引发肌细胞的去极化与肌肉收缩,而多余的Ach由乙酰胆碱酯酶将其水解,阻止Ach对肌纤维的持续兴奋作用,保证突触传递与肌肉活动的精确性。我们以往的研究表明大鼠咀嚼形成过程中Ach受体种类、数量均发生变化,并且粉食喂养对这一变化产生影响[1],而对AchE在咀嚼形成过程中的表达变化及咬合功能负荷对其影响尚不清楚,本实验利用酶组织化学染色方法,对大鼠离乳后咬肌AchE的变化进行初步研究。

1.材料和方法

1.1 动物分组与取材

选择出生后18d的雄性SD大鼠(军事医学科学院动物试验中心)40只,按照完全随机实验设计,将大鼠分为固体组、粉食组,每组20只。分别喂养标准颗粒状固体鼠粮与粉状鼠粮(北京科澳协力饲料有限责任公司),两种鼠粮营养成分相同。在大鼠3、4、6、9周龄时处死,每次粉、固体组各5只,乌拉坦麻醉后取表层咬肌,迅速置于液氮备用,以恒冷切片机作连续纵行冰冻切片备用,片厚10μm。

1.2 乙酰胆碱酯酶染色(Karnovsky-Roots法)

乙酰胆碱酯酶染色采用Karnovsky-Roots法,先于染色前半小时配置孵育液(将碘化乙酰硫代胆碱5mg溶于0.1M醋酸钠缓冲液6.5ml,搅拌,依次加入0.1M柠檬酸钠0.5ml,30mM硫酸铜1ml,蒸馏水1ml,5mM铁氰化钾1ml),要求孵育液呈清亮绿色,PH值控制在6左右。将所有待测切片取出后风干30min,之后4%甲醛钙固定30sec,流水冲洗10sec,将组织周围液体擦去,置于湿盒,滴加加孵育液,置于37℃孵箱1h,镜下观察染色程度,呈淡棕色时流水冲洗5min,同时终止所有待测切片孵育,蒸馏水冲洗后二甲苯透明、甘油明胶封片。

1.3 图像分析及统计

每个标本均选取连续5张切片,每张切片取5个视野,利用Image-pro plus 5.1图象分析软件(Media Cybernetics,Inc,USA)分析 AchE 平均光密度值(mean optical density,mOD),利用SPSS 12.0进行双因素方差分析与t检验,对时间因素与食物因素对mOD的影响进行分析,结果以均数±标准差形式表达(),p<0.05视为有显著性统计差异。

2.结果

光镜下,咬肌运动终板AchE染色呈棕黄色至棕褐色的椭圆外形,运动终板集中分布,形成终板带,见图1。

图1 大鼠4周时咬肌运动终板AchE染色(Karnovsky-Roots法,H&E复染),A:终板带,100×;B:局部放大,200×

标准固体饮食组大鼠在出生后3-9wAchE强度呈逐渐上升趋势,其中出生后4w、6w的AchE含量较3w分别增加了7.53%与9.83%,与3周有明显差异(p<0.05),见图2。

在粉状食物喂养下,大鼠咬肌AchE强度呈现与固体组相似的变化趋势,3w到6w均逐渐上升,明显强于3w时水平,9w表达有所下降,与3w时没有显著差异。方差分析显示,两种食物对于3-9w大鼠咬肌的AchE含量的影响不具统计意义(p> 0.05),见图 2。

图2 大鼠咬肌AchE含量在发育中的变化,*p<0.05,各组与3周时相比。

3.讨论

以往对咀嚼形成过程中咀嚼中枢神经元、咀嚼肌肌纤维功能、形态变化的研究较多,采用的动物模型有拔牙、咬合抬高等[2],这些模型均具有一定创伤性,本研对大鼠喂养粉状鼠粮,造成咬肌功能负荷下降,完全无创,避免了创伤对结果的影响,并且对大鼠体重无显著影响。AchE染色采用经典的Karnovsky-Roots法,通过乙酰胆碱酯酶水解碘化乙酰硫代胆碱,产生硫代胆碱,硫代胆碱含有硫氢基,可以把铁氰化钾还原为亚铁氰化钾,同离子结合后形成棕褐色的亚铁氰化铜,在酶活性区沉淀,其染色深浅与AchE含量有关,从而反映突触活动的变化[3]。

大鼠在出生后3-4周开始形成咀嚼,4w后基本已经形成成熟的咀嚼模式,大鼠下颌运动的形式、幅度,咀嚼肌负荷均与之前的吮吸阶段有着显著差异,反映了咀嚼中枢传出冲动的形成与变化[4],引发三叉神经运动支末梢释放Ach,与运动终板的Ach受体结合,引起咬肌的收缩。在生理状态下,每次神经冲动都会释放大量的Ach,远超过运动终板Ach受体结合所需,多余的Ach将由AchE迅速水解,避免肌肉的持续去极化与收缩[5]。正是由于AchE与突触传递的这种密切关系,AchE含量的变化可以在一定程度上反映突触活动的变化。Pregelj等[6]利用后肢悬吊实验造成大鼠比目鱼肌负荷的下降,发现AchE mRNA显著下降,而负荷增加可以显著增加AchE mRNA表达。AchE这种对于功能变化的敏感性与年龄有关,Boudreau-Lariviere[7]等发现去神经支配可以迅速引起成年大鼠肌肉AchE mRNA表达大幅的下降,而幼鼠下降的幅度明显低于成年鼠,说明成年大鼠肌肉对于失神经支配更为敏感;除此之外,不同肌纤维类型中的AchE对功能变化的敏感性也不同,例如在慢肌AchE含量只是快肌含量的30%,在悬吊实验8天后,慢肌的AchE并没有大的变化,而快肌则下降到对照的80%左右[8],说明快肌纤维AchE含量对负荷降低更为敏感。不同亚型的AchE敏感性也不同,G4型表达对对功能变化敏感,而不对称型AchE则不敏感[9]。

在本研究中,出生后3至6w大鼠咬肌AchE表达显著上升,此阶段是大鼠咀嚼形成时期,咀嚼活动的增加、功能负荷的增强引起AchE表达的增加,但粉食喂养引起的功能负荷降低未引起AchE的显著变化,这可能与以下因素有关:(1)功能负荷下降的程度,粉食喂养没有完全阻断咬肌功能负荷,仅会导致咀嚼时间与咬肌负荷强度的下降[10],其功能负荷下降程度较低;(2)大鼠年龄,本研究大鼠处于幼年发育过程中,这一阶段对于功能负荷变化的敏感性弱于成熟期;(3)肌纤维类型,尽管我们以往研究表明,粉食喂养可以增加咬肌2b纤维比例,降低2a纤维比例,但二者均为快肌纤维,这造成粉、固食组大鼠咬肌AchE含量没有大的差异;(4)可能与咬肌中AchE类型有关,咬肌中AchE组成、不对称型AchE与G4型AchE的比例现仍不清楚,有待于进一步研究。

总之,幼年大鼠咬肌AchE表达对粉食喂养造成的功能负荷下降不敏感,可以保证运动终板部位有足量的AchE,确保不同功能活动下突触传递的有效性与精确性,有利于个体咀嚼模式的建立与成熟,而完全性的阻断咬肌功能活动对其有何影响仍有待于进一步研究。

[1]马军利,刘洪臣,王冠超,等.软食喂养对发育中大鼠咬肌乙酰胆碱受体亚基mRNA表达的影响[J].临床口腔医学杂志,2008,24(8):473-475

[2]贾 静,刘洪臣,黄 湛,等.咬合创伤大鼠行为学及营养状况观察[J].中华老年口腔医学杂志,2005,3(2):111-112

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