发育中大鼠咬肌乙酰胆碱酯酶含量的变化及功能负荷对其影响*

马军利 顾 斌 王冠超 鄂玲玲 刘洪臣

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AchE)是一种具有乙酰胆碱(acetylcholine，Ach)降解活性的酶，广泛分布于骨骼肌、中枢、外周神经系统、以及胆碱能神经元支配的内、外分泌腺、平滑肌、心肌等组织，大量聚集于神经肌肉接头，是神经肌肉接头重要组成部分。神经冲动刺激神经末梢释放大量的Ach，与突触后nAch受体结合，引发肌细胞的去极化与肌肉收缩，而多余的Ach由乙酰胆碱酯酶将其水解，阻止Ach对肌纤维的持续兴奋作用，保证突触传递与肌肉活动的精确性。我们以往的研究表明大鼠咀嚼形成过程中Ach受体种类、数量均发生变化，并且粉食喂养对这一变化产生影响[1]，而对AchE在咀嚼形成过程中的表达变化及咬合功能负荷对其影响尚不清楚，本实验利用酶组织化学染色方法，对大鼠离乳后咬肌AchE的变化进行初步研究。

1.材料和方法

1.1 动物分组与取材

选择出生后18d的雄性SD大鼠(军事医学科学院动物试验中心)40只，按照完全随机实验设计，将大鼠分为固体组、粉食组，每组20只。分别喂养标准颗粒状固体鼠粮与粉状鼠粮(北京科澳协力饲料有限责任公司)，两种鼠粮营养成分相同。在大鼠3、4、6、9周龄时处死，每次粉、固体组各5只，乌拉坦麻醉后取表层咬肌，迅速置于液氮备用，以恒冷切片机作连续纵行冰冻切片备用，片厚10μm。

1.2 乙酰胆碱酯酶染色(Karnovsky-Roots法)

乙酰胆碱酯酶染色采用Karnovsky-Roots法，先于染色前半小时配置孵育液(将碘化乙酰硫代胆碱5mg溶于0.1M醋酸钠缓冲液6.5ml，搅拌，依次加入0.1M柠檬酸钠0.5ml，30mM硫酸铜1ml，蒸馏水1ml，5mM铁氰化钾1ml)，要求孵育液呈清亮绿色，PH值控制在6左右。将所有待测切片取出后风干30min，之后4%甲醛钙固定30sec，流水冲洗10sec，将组织周围液体擦去，置于湿盒，滴加加孵育液，置于37℃孵箱1h，镜下观察染色程度，呈淡棕色时流水冲洗5min，同时终止所有待测切片孵育，蒸馏水冲洗后二甲苯透明、甘油明胶封片。

1.3 图像分析及统计

每个标本均选取连续5张切片，每张切片取5个视野，利用Image-pro plus 5.1图象分析软件(Media Cybernetics，Inc，USA)分析 AchE 平均光密度值(mean optical density，mOD)，利用SPSS 12.0进行双因素方差分析与t检验，对时间因素与食物因素对mOD的影响进行分析，结果以均数±标准差形式表达()，p＜0.05视为有显著性统计差异。

2.结果

光镜下，咬肌运动终板AchE染色呈棕黄色至棕褐色的椭圆外形，运动终板集中分布，形成终板带，见图1。

图1 大鼠4周时咬肌运动终板AchE染色(Karnovsky-Roots法，H＆E复染)，A：终板带，100×；B：局部放大，200×

标准固体饮食组大鼠在出生后3-9wAchE强度呈逐渐上升趋势，其中出生后4w、6w的AchE含量较3w分别增加了7.53%与9.83%，与3周有明显差异(p＜0.05)，见图2。

在粉状食物喂养下，大鼠咬肌AchE强度呈现与固体组相似的变化趋势，3w到6w均逐渐上升，明显强于3w时水平，9w表达有所下降，与3w时没有显著差异。方差分析显示，两种食物对于3-9w大鼠咬肌的AchE含量的影响不具统计意义(p＞ 0.05)，见图 2。

图2 大鼠咬肌AchE含量在发育中的变化，*p＜0.05，各组与3周时相比。

3.讨论

以往对咀嚼形成过程中咀嚼中枢神经元、咀嚼肌肌纤维功能、形态变化的研究较多，采用的动物模型有拔牙、咬合抬高等[2]，这些模型均具有一定创伤性，本研对大鼠喂养粉状鼠粮，造成咬肌功能负荷下降，完全无创，避免了创伤对结果的影响，并且对大鼠体重无显著影响。AchE染色采用经典的Karnovsky-Roots法，通过乙酰胆碱酯酶水解碘化乙酰硫代胆碱，产生硫代胆碱，硫代胆碱含有硫氢基，可以把铁氰化钾还原为亚铁氰化钾，同离子结合后形成棕褐色的亚铁氰化铜，在酶活性区沉淀，其染色深浅与AchE含量有关，从而反映突触活动的变化[3]。

大鼠在出生后3-4周开始形成咀嚼，4w后基本已经形成成熟的咀嚼模式，大鼠下颌运动的形式、幅度，咀嚼肌负荷均与之前的吮吸阶段有着显著差异，反映了咀嚼中枢传出冲动的形成与变化[4]，引发三叉神经运动支末梢释放Ach，与运动终板的Ach受体结合，引起咬肌的收缩。在生理状态下，每次神经冲动都会释放大量的Ach，远超过运动终板Ach受体结合所需，多余的Ach将由AchE迅速水解，避免肌肉的持续去极化与收缩[5]。正是由于AchE与突触传递的这种密切关系，AchE含量的变化可以在一定程度上反映突触活动的变化。Pregelj等[6]利用后肢悬吊实验造成大鼠比目鱼肌负荷的下降，发现AchE mRNA显著下降，而负荷增加可以显著增加AchE mRNA表达。AchE这种对于功能变化的敏感性与年龄有关，Boudreau-Lariviere[7]等发现去神经支配可以迅速引起成年大鼠肌肉AchE mRNA表达大幅的下降，而幼鼠下降的幅度明显低于成年鼠，说明成年大鼠肌肉对于失神经支配更为敏感；除此之外，不同肌纤维类型中的AchE对功能变化的敏感性也不同，例如在慢肌AchE含量只是快肌含量的30%，在悬吊实验8天后，慢肌的AchE并没有大的变化，而快肌则下降到对照的80%左右[8]，说明快肌纤维AchE含量对负荷降低更为敏感。不同亚型的AchE敏感性也不同，G4型表达对对功能变化敏感，而不对称型AchE则不敏感[9]。

在本研究中，出生后3至6w大鼠咬肌AchE表达显著上升，此阶段是大鼠咀嚼形成时期，咀嚼活动的增加、功能负荷的增强引起AchE表达的增加，但粉食喂养引起的功能负荷降低未引起AchE的显著变化，这可能与以下因素有关：(1)功能负荷下降的程度，粉食喂养没有完全阻断咬肌功能负荷，仅会导致咀嚼时间与咬肌负荷强度的下降[10]，其功能负荷下降程度较低；(2)大鼠年龄，本研究大鼠处于幼年发育过程中，这一阶段对于功能负荷变化的敏感性弱于成熟期；(3)肌纤维类型，尽管我们以往研究表明，粉食喂养可以增加咬肌2b纤维比例，降低2a纤维比例，但二者均为快肌纤维，这造成粉、固食组大鼠咬肌AchE含量没有大的差异；(4)可能与咬肌中AchE类型有关，咬肌中AchE组成、不对称型AchE与G4型AchE的比例现仍不清楚，有待于进一步研究。

总之，幼年大鼠咬肌AchE表达对粉食喂养造成的功能负荷下降不敏感，可以保证运动终板部位有足量的AchE，确保不同功能活动下突触传递的有效性与精确性，有利于个体咀嚼模式的建立与成熟，而完全性的阻断咬肌功能活动对其有何影响仍有待于进一步研究。

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