大鼠急性牙髓炎造成中枢致敏时三叉神经脊束核极间亚核和孤束核c-fos蛋白的时程变化*

顾 斌 刘洪臣 马军利 郭 宏

神经系统内c-fos蛋白的表达及分布特点可以做为生物学指标，衡量外周刺激引起相关神经元的伤害性反应，探索神经网络的调节变化机制。本实验在前期建立大鼠急性牙髓炎模型的基础上，通过测定牙髓炎致敏过程中延髓中三叉神经脊束核极间亚核和孤束核c-fos蛋白的表达情况，研究c-fos变化规律。

1.材料与方法

1.1 动物模型及实验分组 选取SD大鼠30只，将其平均分为5组，一组为正常对照组，其余4组为实验组，分别为开髓后封脂多糖(Lipopolysac charide，LPS)6小时、12小时、24小时、48小时组[1]。

1.2 材料 兔抗c-fos抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；二步法免疫组化试剂盒(中山金桥生物技术公司)，DAB试剂盒(中山金桥生物技术公司)。

1.3 免疫组化实验 在预定时间点灌注取出延髓，置于4%多聚甲醛固定液中固定10h(4℃)。制备石蜡切片，以闩平面为基准，连续切片，片厚40μm，每5张取1片；尾侧切取8组切片，长约1.6mm，吻侧切取5组切片，长约1mm(包含Vc核)，置于4℃保存，切片均由解放军总医院病理科制备。

取一套切片脱蜡；3%H2O2室温孵育5-10min，将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃-98℃之间并持续10-15min，取出容器，室温冷却10-20min，PBS洗5min；5-10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育30min。倾去血清，滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育1-2h或4℃过夜(同时做不加一抗的阴性对照)；PBS冲洗后滴加适当比例稀释的二抗稀释液，37℃孵育30min；DAB显色；另取一套切片不加抗体做为阴性对照组。

每张切片相应的核团均取四个高倍视野，计数c-fos阳性神经元数目，计算各组动物Vi和NTS内c-fos表达数目的均值,以均数±标准差表示。

1.4 统计分析 统计过程采用SPSS软件进行方差分析。

2.结果

用免疫组化方法观察c-fos在Vi核、孤束核的表达情况。阳性细胞计数结果见表1，总体变化趋势见图1-图3。

在LPS致急性牙髓炎致敏后，与对照组相比，实验侧Vi核c-fos阳性神经元表达数目明显增加(p＜0.01)，并呈时间依赖性，从6小时至12小时表达上升；对侧Vi核的c-fos表达数目少于实验侧(p＜0.01)，变化趋势为逐渐增多(图1、图2)。

与对照相比，在炎症形成的全程(6h至48h)，双侧孤束核的c-fos阳性神经元数目均显著增加(p＜0.01)，6h最高，之后随时间增加而逐渐降低(图 3)。

3.讨论

图1 牙髓炎致敏后Vi、NTS核实验侧c-fos阳性神经元数变化趋势图(*p＜0.01，与前一时间点比较)

图2 Vi核实验侧和对侧fos阳性神经元表达变化趋势(#p＜0.01,与对侧对比 *p＜0.01，与前一时间点比较)

图3 孤束核实验侧和对侧c-fos阳性神经元表达变化趋势(#p＜0.01,与对侧对比 *p＜0.01，与前一时间点比较)

表1 急性牙髓炎致敏大鼠Vi核、孤束核c-fos蛋白的阳性表达数目(均值±SD)

机体接受不同伤害性刺激时，中枢神经系统可发生功能和结构的变化，此时，脑干中相关核团c-fos的时空分布出现特定的变化规律，反映中枢致敏的具体信息[2]。皮肤损伤、关节损伤、内脏损伤会造成中枢神经系统c-fos蛋白不同的表达模式。研究c-fos蛋白的变化对理解外周炎症与外周神经系统、中枢神经系统致敏的相互关系具有重要的意义，对于后期疼痛的治疗也很有帮助。

在前期的实验中，我们研究大鼠急性牙髓炎造成中枢致敏时Vc核内c-fos蛋白的变化情况，发现在封药后12h至24h，Vc核c-fos阳性神经元表达数目显著增多[3]。

有研究证实，三叉神经脊束核的Vi核也参与了牙齿感觉信号的传递过程，一些电生理和c-fos研究发现，当牙髓接受化学刺激或电刺激时，Vi的神经元会被激活[4,5]。神经解剖学研究也证实，三叉神经脊束核吻侧亚核(Vo)的神经元部分直接投射到Vc核,而支配牙髓感觉的传入神经纤维直接投射到Vo，Vi[6]。本实验发现位于Vc核吻侧的Vi核神经元c-fos表达变化趋势类似于VC核团，只是阳性神经元的密度低于尾侧亚核，与对照组相比，实验侧Vi核6-48小时表达均增强(p＜0.01),说明Vi参与了中枢致敏的进程。在2007年，worsley等[7]对牙齿施加电刺激，发现Vi区没有明显的c-fos表达。这可能是由于动物种属和刺激方式的差异造成的。

在本研究中，对侧Vi核在24小时以后才表达增加(p＜0.01)，这可能是由于Vi的神经元电生理特点类似与VC深层的神经元，含有较多的广动力(wide-dynamic-range WDR)神经元，神经信号需要通过多级传导才能激活。

实验中，我们观察到双侧孤束核均出现了急性的c-fos表达增高现象，在6h最高，以后逐渐降低(图3)，这可能与动物的情感及应激性刺激有关,需要进一步研究分析。

本研究进一步说明在大鼠牙髓炎发展进程中，中枢相关核团的变化情况，反映出中枢致敏与牙髓炎进展的相关性。

[1]顾 斌，刘洪臣，马军利，等.大鼠急性牙髓炎动物模型的建立[J].中华老年口腔医学杂志，2009，7(5)：304-307

[2]Navarro VP,Rocha MJ,Branco LG.Reduced central c-fos expression and febrile response to repeated LPS injection into periodontal tissue of rats[J].Brain Res,2007，1152：57-63

[3]顾 斌，刘洪臣，马军利，等.急性牙髓炎致敏时Vc核c-fos蛋白的时程变化[J].中华老年口腔医学杂志，2010，8(6)：321-323

[4]Allen GV,Barbrick B,Esser MJ.Trigeminal-parabrachial connections：possiblepathway for nociception-induced cardiovascular reflex responses[J].Brain Res， 1996， 715(1-2)：125-135

[5]Hamba M.Stimulation-induced responses of the trigeminal caudal neurons in the brainstem preparation isolated from newborn rats[J].Brain Res，1998，785(1)：66-74

[6]Marfurt CF,Turner DF.The central projections of tooth pulp afferent neurons in the rat as determined by the transganglionic transport of horseradish peroxidase[J].J Comp Neurol,1984，223(4)：535-547

[7]Worsley MA,Davies SL,Clayton NM,et al.The effect of inflammation on Fos expression in the ferret trigeminal nucleus[J].Eur J Oral Sci，2007，115(1)：40-47