低密度脂蛋白受体第 12外显子基因突变与高胆固醇血症的关系

张明明，马 倩，王俊明，帖彦青，宋光耀(河北省人民医院，石家庄 050051)

研究表明，低密度脂蛋白受体(LDL-R)与血浆胆固醇水平关系密切，该基因异常可导致血浆胆固醇水平显著上升[1]。LDL-R基因多态性可影响LDL-C、TC水平[2]，但具体突变情况尚不完全明确。本研究采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性分析技术(PCR-RFLP)结合 DNA直接测序技术对LDL-R基因第 12外显子 Asp589CysfsX12突变在不同胆固醇水平者的基因和基因型频率进行了分析。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择 2008年 12月 ～2009年 12月在我院体检中心体检者 1 685例，按照 TC水平分为3组:①高胆固醇血症组 (HTC组)800例，男 457例、女 343例，年龄(47.61±11.51)岁，TC≥6.22 mmol/L(240 mg/dl);②边缘高胆固醇血症组(BTC组)500例，男 286例、女 214例，年龄 (47.16±11.36)岁，5.18 mmol/L＜TC＜6.19 mmol/L(200＜TC＜239 mg/dl);③正常对照组(NC组)385例，男220例 、女 165例 ，TC≤5.18 mmol/L(200 mg/dl)，且 LDL-C＜3.12 mmol/L。血脂异常按 2007年《中国成人血脂异常防治指南》[3]的标准，并排除甲状腺功能亢进、甲状腺功能减退、慢性肝病、糖尿病、糖尿病肾病、肾病综合征、肾移植术后等影响糖脂代谢的疾病或影响糖脂代谢药物者。

1.2 方法

1.2.1 血脂测定 入组者空腹12 h，次日晨抽取肘静脉血 4 ml，分离血清，待测血脂;另取 4 ml置于EDTA抗凝管中，-80℃保存，用于提取 DNA。TC、TG、HDL-C、LDL-C、VLDL由 Beckman全自动生化分析仪采用酶法测定。

1.2.2 PCR-RFLP分析 LDL-R基因的多态性 ①基因组 DNA提取:EDTA抗凝血 400μl按照天根血液基因组 DNA提取试剂盒(离心柱型)说明书提取基因组 DNA。②PCR扩增 LDL-R基因片段:上游引物:5'-GCACGTGACCTCTCCTTATCCACTT-3'，下 游引 物 :5'-CACCTAAGTGCTTGCATCTCGTACG-3'。 PCR反应体系共 20μl，反应条件见参考文献[4]。③限制性片段多态性分析:PCR产物用限制性内切酶 ClaI进行酶切，反应体系共 20μl，37℃水浴酶切 4 h后终止反应。酶切产物经 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳(100 mV，50 min)，用 UVPGD-8000凝胶图像分析系统照相、鉴定。

1.2.3 DNA序列分析 PCR扩增产物纯化后直接测序(双向测序)。

1.3 统计学方法 采用 SPSS13.0统计软件，计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析，基因频率采用基因计数法计算;组间基因型与等位基因频率比较采用 χ2检验，危险因素分析采用单因素及多因素 Logistic回归分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组 BMI、血脂水平比较 见表1。

表1 三组 BMI、血脂水平比较(±s)

表1 三组 BMI、血脂水平比较(±s)

注:与 NC组比较，*P＜0.05;与 BTC组比较，△P＜0.05

组别 n BMI(kg/m2)TC(mmol/L)TG(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)NC组 385 24.11±2.44 4.41±0.55 1.12±0.34 1.29±0.19 2.65±0.43 BTC组 500 26.05±2.97*5.69±0.39* 1.09±0.57 1.07±0.32* 4.12±0.76*HTC组 800 25.41±2.73*8.95±0.89*△1.15±0.37 1.19±0.39*△6.92±0.84*△

2.2 LDL-R基因 Asp589CysfsX12突变基因型情况

2.2.1 PCR-RFLP分型 根据限制性内切酶 ClaI的酶切情况，分为 DD、DC和 CC基因型。PCR产物为 210 bp，DD纯合子有酶切位点得到 117、93两条酶切片段，DC杂合子为 210、179和 159 bp三条片段，CC突变纯合子因无 ClaI酶切位点，仍为 210 bp的 1条条带。见图1。

图1 PCR-RFLP分型

2.2.2 DNA序列分析 酶切后取 PCR产物纯化后进行双向测序。Asp589CysfsX12突变位于 LDL-R基因第 12外显子，第 1 764～1 765位碱基 CG缺失，第 589位氨基酸由 GAT变为 TGT，原有的 ClaI酶切位点(AT↓CGAT)消失。

2.3 LDL-R基因 Asp589CysfsX12突变基因型和等位基因频率分布 见表2。

表2 LDL-R基因第 12外显子 Asp 589CysfsX 12突变基因型和等位基因频率分布[例(%)]

2.4 LDL-R基因 Asp589CysfsX12突变不同基因型间血脂水平的比较 见表3。

2.5 多元线性回归结果 TC作为因变量(y)，以性别、年龄、BMI、TC、TG、HDL-C、基因型为自变量 ，进行多元线性回归分析，最后 CC基因型、HDL-C进入方程。回归方程为:y=0.346(基因型)-0.275(HDL-C)+1.632(P均 ＜0.05)。见表4。

3 讨论

表3 LDL-R基因 Asp 589CysfsX 12突变不同基因型间血脂水平的比较(mmol/L，±s)

表3 LDL-R基因 Asp 589CysfsX 12突变不同基因型间血脂水平的比较(mmol/L，±s)

指标 血脂水平DD DC CC F P TC 6.01±1.27 7.22±1.38 9.70±1.75 67.38 ＜0.05 TG 1.00±0.31 1.02±0.30 0.91±0.28 1.04 ＞0.05 HDL 1.19±0.28 1.11±0.30 1.01±0.29 3.48 ＜0.05 LDL 4.51±1.75 5.70±1.61 8.31±2.21 64.58 ＜0.05 VLDL 0.97±0.35 0.91±0.34 0.98±0.29 0.56 ＞0.05

表4 多元回归分析结果

高胆固醇血症是心脑血管疾病的独立危险因素，近年来其发病率逐年上升[5]。LDL-R功能缺陷是引起高胆固醇血症的重要原因，因此关于 LDL-R功能缺陷的研究已成为目前研究的热点。本研究在LDL-R基因第 12外显子中发现了框移突变(1 764～1 765 del，Asp589CysfsX12)，碱基 CG缺失，第 12外显子 589位密码子由 GAT变为 TGT，突变部位以后的碱基出现框移，其后氨基酸序列出现错误，终止密码子提前出现，使肽链在合成过程中提前中断。本研究在 HTC组和 BTC组中还发现了 Asp589CysfsX12突变的纯合子和杂合子，而正常对照组未发现纯合子;同时发现 HTC组的 C等位基因、CC基因型、DC基因型的频率明显高于 BTC症组和 NC组，同时发现血清TC、LDL-C的水平随 DD、DC、CC基因型的改变有逐渐上升的趋势，而 HDL-C随 DD、DC、CC基因型的改变有逐渐下降的趋势，提示 CC基因型和 C等位基因与血清胆固醇水平的升高有关。多元回归分析发现，CC基因型是高胆固醇血症的危险因素，说明LDL-R基因突变与血清胆固醇水平的升高有关，但具体机制有待深入研究。

[1]郭阳，郭津津，刘晓梅，等.低密度脂蛋白受体基因 NcoⅠ、apoCⅢ基因 SacⅠ基因多态性与动脉粥样硬化脑梗死的关系[J].中国医科大学学报，2005，34(5):454-456.

[2]Snozek CL，Lagerstedt SA，Khoo TK，et al.LDLRpromoter variant and exon 14 mutation on the same chromosome are associated with an unusually severe FH phenotypeand treatment resistance[J].Eur J Hum Genet，2009，17(1):85-90.

[3]中国成人血脂异常防治指南制定联合委员会.中国成人血脂异常防治指南[J].中华心血管病杂志，2007，359(5):390-409.

[4]张明明，宋光耀，张新，等.LDL受体基因第 4外显子 Xsp I位点多态性与高胆固醇血症的相关性研究[J].中华内分泌代谢杂志，2009，25(1):49-51.

[5]钱伟，钱志远.高胆固醇血症的危害与现行对策[J].实用预防医学，2009，16(2):632-634.