RP-HPLC法测定不同采收期广东紫珠、大叶紫珠中木犀草素的含量Δ

周日宝，刘笑蓉，唐丽君，刘佳胜（1.湖南中医药大学药学院，长沙市 41008；.湖南中医药大学008级研究生班，长沙市 41008）

广东紫珠（Callicarpa kwangtungensis Chun）是中成药抗宫炎片的主要原料[1]。抗宫炎片具有止血散瘀、解毒消肿的功能，临床用于治疗宫颈炎、宫颈糜烂、盆腔炎、附件炎等妇科疾病，疗效显著。近期临床报道，抗宫炎片的临床应用范围不断拓宽，在治疗急慢性咽炎、慢性前列腺炎、慢性痢疾与结肠炎等疾病方面也有了新的应用，疗效确切[2]。随着抗宫炎片生产规模的不断扩大，对广东紫珠的需求也随着激增，野生资源已远远不能满足生产的需求，原料药材供不应求，故市场上还大量使用了大叶紫珠（C.macrophylla Vahl.）替代广东紫珠作为紫珠原料药材。

紫珠中含有黄酮、萜类及脂肪酸、氨基酸、甾醇、挥发油、无机元素等其他成分，主要有效成分为黄酮和萜类[3]。木犀草素及其苷是紫珠中一类含量较多的有效成分[4]，其药理活性研究已有报道[5]，但未见紫珠中木犀草素的含量测定报道。故笔者选择木犀草素作为指标成分，采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法测定上述2种紫珠药材中木犀草素的含量，研究不同采收期木犀草素动态变化规律，为这2种药材的半野生人工抚育及人工栽培提供科学依据，以便扩大抗宫炎片的药用资源，满足市场需求。

1 仪器与试药

HPLC仪，包括HT-230A柱温箱、G1314B VWD检测器、G1329A自动进样器、Agilent 1200工作站（美国Agilent公司）；数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FA2004电子天平（上海恒平科学仪器有限公司）；SHB-Ⅲ循环式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；101-3AB型电热鼓风干燥箱、FW135型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；RE-52A旋转蒸发器、KQ-C型玻璃仪器气流烘干器（巩义市英峪予华仪器厂）。

乙醇为分析纯，甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯；木犀草素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111520-200504）；药材样品采自湖南省会同县紫珠规范化种植研究试验基地，经湖南中医药大学潘清平教授鉴定系马鞭草科紫珠属广东紫珠（C.kwangtungensis Chun）、大叶紫珠（C.macrophylla Vahl.），从2009年10月12日起至2009年12月21日止，每隔10天采集植株，分别晒干，取植株的茎作药材样品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Alltech C18（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：甲醇-0.3%磷酸水（47∶53）；检测波长：352 nm；流速：1 mL·min-1；柱温：30℃；进样量：10µL。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.木犀草素对照品；B.大叶紫珠提取液；1.木犀草素Fig 1 HPLC chromatogramsA.luteolin control；B.C.macrophylla extract；1.luteolin

2.2 对照品溶液的制备

精密称取木犀草素对照品适量，加甲醇制成30µg·mL-1的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

称取药材粉末（过60目）约3 g，加95%乙醇50 mL，80℃超声波（功率：350 W，频率：40 kHz）提取3次，每次1 h，合并滤液，滤过，减压回收乙醇，残渣加甲醇溶解并定容至25 mL，摇匀，3000 r·min-1离心5 min，用0.45 µm微孔滤膜过滤，即得。

2.4 线性关系考察

取对照品溶液（30 µg·mL-1），分别进样0.5、1、4、5、8、10µL，记录峰面积。以木犀草素进样量（X，µg）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，制备标准曲线，得回归方程为Y＝4017.7X－2.9473（r＝0.9999，n＝6）。结果表明，木犀草素进样量在0.015～0.300µg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

取对照品溶液，重复进样5次，每次10µL，测定木犀草素峰面积。结果，RSD＝1.32%（n＝5），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，于制备后放置0、2、4、6、8、12、24 h，分别精密吸取10µL注入液相色谱仪，测定木犀草素峰面积。结果，RSD＝1.21%（n＝7），表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。

2.7 重复性试验

取同一批样品适量，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别精密吸取10µL注入液相色谱仪，测定。结果，木犀草素的平均含量为70.01 µg·g-1，RSD＝1.10%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

称取已知含量的广东紫珠（12月11日采集）药材粉末约2.5 g，共6份，精密加入木犀草素对照品溶液6 mL，搅拌均匀，挥干甲醇，余下按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述方法测定样品含量，计算加样回收率，结果见表1。

2.9 样品含量测定

取各批样品适量，采用上述色谱条件按外标法以峰面积计算木犀草素含量[1]，结果见表2。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

表2 不同采收期广东紫珠、大叶紫珠中木犀草素的含量Tab 2 Contents of luteolin in C.kwangtungensis and C.macrophylla in different harvesting time

3 讨论

试验中采用95%乙醇、50%乙醇、水作为提取溶剂进行比较。结果表明，用95%乙醇作为溶剂的提取效果更好。再采用95%乙醇作为提取溶剂分别进行回流提取与超声提取的比较。结果显示，超声提取的含量较高。

从表2中可以得出，大叶紫珠、广东紫珠随着生育期的延长，木犀草素含量逐渐增加，生长末期植株中木犀草素的含量达到最高。该结果可为大叶紫珠和广东紫珠野生改人工栽培的生产实践中确定药材最佳采收期、确保药材内在质量提供一定的试验依据。

本试验通过比较8个不同采收期2种紫珠药材中木犀草素的含量结果可知，大叶紫珠中木犀草素的含量普遍高于广东紫珠，该结果可为进一步探讨大叶紫珠与广东紫珠共同作为抗宫炎片的原料药材提供一定的科学支撑。

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：756、附录36.

[2]马延升，朱兰翠.抗宫炎片临床进展[J].中国现代医学杂志，2004，14（10）：69.

[3]王振华，杜 勤.紫珠属化学成分研究及其临床应用[J].广东药学，1998，8（3）：5.

[4]王祝年，韩 壮，崔海滨，等.裸花紫珠的化学成分[J].热带亚热带植物学报，2007，15（4）：359.

[5]李星霞，郭 澄.木犀草素的药理活性研究[J].中国药房，2007，18（18）：1421.