石榴皮鞣质的急性毒性研究

邱红梅，赖舒，尚京川，周岐新#（.重庆医科大学药学院药理教研室/重庆市生物化学与分子药理学重点实验室，重庆市 40006；.重庆医科大学药物分析教研室，重庆市 40006）

石榴皮为石榴科植物石榴的干燥果皮。实验证明，石榴皮提取物有明显的对抗实验性胃损伤作用，且其胃黏膜保护作用可能与石榴皮提取物中的主要成分单宁有关。药理研究证明，从桃金娘科植物蒲桃皮水浸液中提取的含量为13.4%的单宁对盐酸-乙醇诱导的大鼠胃黏膜损伤有明显的保护作用[1]；石榴皮鞣质（单宁含量约73%）对实验性胃损伤也有明显的保护作用[2]。但也有文献报道单宁能导致人肝坏死[3]；实验研究也证实其可引起小鼠肝脏毒性[4]。因此，在开发石榴皮提取物的潜在应用时，需要评估其安全性。为此，笔者对石榴皮提取物石榴皮鞣质进行了初步的急性毒性实验研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器

SZ297型自动三重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；保温干燥箱（重庆实验设备厂）；A2000S型电子分析天平（德国Sartorius公司）；721型分光光度计（上海第三分析仪器厂）；电热恒温水浴锅（北京长安科学仪器厂）。

1.2 试药

干燥石榴皮（徐州医药有限公司中药饮片厂，批号：070911，参照丙酮提取、醋酸乙酯萃取法从石榴皮中提取鞣质，由重庆医科大学化学教研室尚京川教授提供，其总单宁含量为73%）。实验所用试剂均为分析纯。

1.3 动物

健康昆明种小鼠，♀♂兼半，体重20～25 g，由重庆医科大学动物实验中心提供（动物合格证号：SCXK（渝）200220001）。

2 方法

2.1 石榴皮鞣质混悬液的制备

精密称取石榴皮鞣质10.27 g，置于研钵中，10 mL0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液分多次加入，每次加入后尽量研磨石榴皮鞣质至细腻，即得浓度为102.7%的石榴皮鞣质混悬液。避光保存，备用。用前摇匀，并将其作为预实验中的最大给药浓度。

2.2 石榴皮鞣质引起小鼠死亡的最小致死量（Dmin）和最大致死量（Dmax）的确定

单宁的半数致死量（LD50）为6000 mg·kg-1，石榴皮经丙酮提取得到的石榴皮鞣质含单宁73%，故选用9只小鼠（♀♂兼半），分为2739、8219、24657 mg·kg-1剂量给药，给药容积为0.2 mL·10 g-1，观察小鼠在给药后7 d内死亡情况，得到Dmin＝8219 mg·kg-1。在Dmin的基础上递减剂量，得到D0%＝4609.81 mg·kg-1，再在Dmin的基础上给药，连续剂量增加的系数是1.15，直到小鼠全部死亡得到Dmax，即D100%＝15963 mg·kg-1。

2.3 分组和给药

根据公式：1/K＝（N－1）×（Dmax－Dmin）/2进行分组（式中：1/K为组间比值；N为分组数）。在D100%和D0%之间取7组。将D100%和D0%的值换算成对数，再按等对数距离分组。70只小鼠随机均分为 A、B、C、D、E、F、G 7个组，剂量分别为 15963.00、12978.00、10551.12、8578.25、6974.19、5670.07、4609.81 mg·kg-1。

2.4 观察指标

2.4.1 观察小鼠的不良反应和死亡情况 给药当天密切观察给药后小鼠的反应情况，然后每天上午8时、下午2时各观察1次，持续观察7 d小鼠的不良反应和死亡情况，记录各组小鼠死亡情况。

2.4.2 肝组织病理形态学观察 各组存活小鼠，给药24 h后断头处死，分离肝脏组织，固定切片，HE染色镜检。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 石榴皮鞣质对小鼠体重的影响

分别于给药前（即0 d）和给药后第3天、第7天称重，发现各组存活小鼠体重无显著性差异，体重在给药停止后逐渐增加。石榴皮鞣质对小鼠体重的影响见表1。

表1 石榴皮鞣质对小鼠体重的影响（±s，n＝10）Tab 1 Effect of P.granatum tannins on body weight of mice（±s，n＝10）

表1 石榴皮鞣质对小鼠体重的影响（±s，n＝10）Tab 1 Effect of P.granatum tannins on body weight of mice（±s，n＝10）

组别A组B组C组D组E组F组G组剂量/mg·kg-1 4609.815670.076974.198578.2510551.1212978.2615963.00体重/g 0 d 20.59±2.2021.94±2.6020.86±1.5220.75±2.3121.36±1.8620.67±1.9020.46±1.233 d 24.54±1.7625.36±1.5523.12±1.2324.33±1.4324.54±1.7622.96±3.1021.87±2.057 d 26.60±2.0827.36±1.0925.65±2.1626.75±2.3126.24±1.4425.30±2.0323.66±1.94

3.2 石榴皮鞣质对小鼠死亡率的影响和LD50计算

各组小鼠死亡多发生在给药后1～3 d内，小鼠死亡率呈剂量依赖性增高，具体表现为对刺激反应减弱或消失，呼吸困难，心跳减弱直至死亡。对死亡小鼠立即解剖，可见肝脏出现白色点状坏死，其它器官均正常。各组存活小鼠亦见类似症状，但较轻，当日或次日即可进食。小鼠ig给予石榴皮鞣质的LD50＝8469.28 mg·kg-1；LD50的95%可信限＝（8469.28±1216.58）mg·kg-1（范围：7252.70～9685.83 mg·kg-1）。石榴皮鞣质对小鼠死亡率的影响见表2。

表2 石榴皮鞣质对小鼠死亡率的影响（±s，n＝10）Tab 2 Effect of P.granatum tannins on mortality of mice（±s，n＝10）

表2 石榴皮鞣质对小鼠死亡率的影响（±s，n＝10）Tab 2 Effect of P.granatum tannins on mortality of mice（±s，n＝10）

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3.3 石榴皮鞣质对小鼠肝组织病理形态学的影响

病理切片显示，随剂量的增加，肝脏组织依次出现气球样改变、胞浆疏松化，点状坏死以及大片状坏死。石榴皮鞣质对小鼠肝脏组织病理形态学的影响见图1。

图1 石榴皮鞣质对小鼠肝组织病理形态学的影响A.A组；B.B组；C.C组；D.D组；E.E组；F.F组；G.G组Fig 1 Effect of P.granatum tannins on pathomorphology of liver tissue in miceA.A group；B.Bgroup；C.C group；D.D group；E.E.E mg·kg-1 group；F.F group；G.G group

4 讨论

石榴皮性温，味甘、酸、涩，具有涩肠、止血、收敛止泻和杀虫功效。石榴皮主要成分为单宁，其含量约为10.4%～21.3%；其他成分包括蜡0.8%、树脂4.5%、甘露醇1.8%、糖2.7%、树胶3.2%、菊粉1.0%、黏质0.6%、没食子酸4.0%等[5]。但也有文献[7]报道，单宁长期大量应用可引起肝小叶中央坏死、脂肪肝、肝硬化，过量服用可引起血清谷丙转氨酶异常增高和严重肝损坏，导致人体肝坏死[8]。单宁还能与皮下蛋白质结合而产生沉淀，甚至能渗透过肝表皮细胞而产生沉淀，导致肝损坏[9]。

石榴皮所含的单宁主要是水解单宁，其毒性主要表现为直接肝脏毒性。本研究结果显示，含单宁73%的石榴皮提取物在给药剂量为15963.00 mg·kg-1时，其致死率为100%，根据改良寇氏法[5，6]求得石榴皮鞣质的LD50＝8469.28mg·kg-1，LD50的 95%可信限＝（8469.28±1216.58）mg·kg-1（范围：7252.70～9685.83 mg·kg-1）。出现死亡的小鼠表现为对刺激反应减弱或消失，呼吸困难，心跳减弱，直至死亡，经过尸检发现有不同程度的肝脏坏死。肝脏病理学研究显示，随石榴皮鞣质剂量的增加，肝脏组织出现剂量依赖性肝损伤和坏死，但其它器官良好，各组存活的小鼠体重无显著性差异，体重在停药后稳步增长。研究表明，石榴皮鞣质应避免大剂量一次性服用，以免造成肝损伤并导致死亡。石榴皮提取物长期小剂量使用的安全性如何，尚需进一步研究。

[1]Ramirez RO，Roa CC Ir.The gastroprotective effect of tannins extracted from duhat（Syzygium cumini Skeels）bark on Hcl/ethanol induced gastric mucosal injury in spraguedawley rats[J].Clin Hemorheol Microcirc，2003，29（3-4）：253.

[2]赖 舒，周岐新，张 颖，等.石榴皮鞣质对实验性胃损伤的作用[J].中国中药杂志，2009，34（10）：1290.

[3]王希海，黄光照.药用植物引起中毒性肝病时的病理变化[J].中西医结合肝病杂志，1996，6（4）：48.

[4]国家中医药管理局中华本草编委会编.中华本草（第5卷）[M].上海：上海科学技术出版社，1999：664.

[5]徐淑云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学[M].第3版.北京：人民卫生出版社，2002：1108.

[6]周绪正，张继瑜.小鼠和大鼠口服氢溴酸槟榔碱的急性毒性试验[J].动物医学进展，2007，28（9）：34.

[7]杨丽平，杨永红.石榴皮的研究进展[J].云南中医中药杂志，2004，25（3）：45.

[8]阮志平.植物单宁与健康[J].中国食物与营养，2006，22（8）：48.

[9]Ogasawara H，Todate A.Subchronic oral toxicity study of tannic acid in F344 rats[J].Eisei Shikenjo Hokoku，1990，10（8）：84.