RP-HPLC法测定人血浆中丙泊酚的浓度

张惠君，王彦，唐芳丽（1.天津第三医院，天津市 0050；.天津医科大学总医院，天津市 0005；.天津医科大学临床医学院药学系，天津市 0085）

丙泊酚（Propofol，异丙酚）化学名为2，6-二异丙基苯酚，是一种新型快速短效静脉全身麻醉药，具有起效快、复苏迅速、持续时间短、苏醒后患者意识清晰、无嗜睡、无眩晕、剂量易于掌握等特点，自20世纪80年代问世以来，被广泛用于麻醉诱导、麻醉维持、麻醉中、手术后与重症监护病房（ICU）的镇静，成为全球用量最大的静脉麻醉药。丙泊酚的血药浓度与药效之间有密切的关系，通过监测其血药浓度，可以调整给药剂量和速度，达到理想的麻醉深度，指导临床合理用药。目前，文献报道的丙泊酚血药浓度检测方法有荧光光谱法[1]、高效液相（HPLC）-紫外检测法[2]、HPLC-荧光检测法[3]、气相色谱（GC）法[4]和气-质联用（GC-MS）法[5]。后2种方法灵敏度较高，所需的样品量少，但仪器设备较昂贵，不易推广；而HPLC-紫外检测器在日常工作中应用广泛。因此，笔者参考有关文献[2，3]，对文献报道的HPLC-紫外检测法作了一些改进，为科研及临床手术中丙泊酚血药浓度的监测提供了一种更为准确、灵敏、快速的检测方法。

1 材料

1.1 仪器

UltiMate3000高效液相色谱仪，包括UltiMate3000二极管阵列检测器、UltiMate 3000二元泵、Dionex Chemeleon色谱工作站（美国戴安公司）；CP225D电子分析天平（德国赛多利斯仪器系统有限公司）；YKH-Ⅲ液体快速混合器（江西医疗器械厂）；800型离心沉淀器（上海手术器械厂）；LD5-2A型离心机（北京医用离心机厂）；舒美KQ218超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SHB-ⅢA循环水式多用真空泵（陕西太康生物科技有限公司）。

1.2 试药

丙泊酚标准品（中国药品生物制品检定所，批号：100806-200801，纯度：99.8%）；乙腈为色谱纯，麝香草酚、磷酸二氢钾、高氯酸、磷酸、盐酸均为分析纯，水为天津医科大学总医院制剂室提供的双重蒸馏水。健康人全血由天津医科大学总医院中心血站提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18烷基键合硅胶柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.01 mol·L－1磷酸二氢钾水溶液（70∶30，磷酸调节pH值至4.0）；内标：麝香草酚；柱温：室温；紫外检测波长：270 nm；流速：1.0 mL·min－1；灵敏度：0.001 AUFS；进样量：20 μL。

2.2 试验溶液的制备

2.2.1 丙泊酚标准贮备液：准确称取丙泊酚标准品10 mg，置于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.1 mg·mL－1的丙泊酚标准贮备液，置4℃冰箱保存。

2.2.2 丙泊酚标准稀释液：精密量取0.1 mg·mL－1的丙泊酚标准贮备液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得浓度为10 μg·mL－1的丙泊酚标准稀释液，置4 ℃冰箱保存。

2.2.3 丙泊酚标准工作液：精密量取10 μg·mL－1的丙泊酚标准稀释液1 mL，用流动相定容于10 mL容量瓶中，摇匀，即得浓度为1 μg·mL－1的丙泊酚标准工作液，置4℃冰箱保存。

2.2.4 麝香草酚标准贮备液：准确称取麝香草酚5.0 g，置于50 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.1 mg·mL－1的麝香草酚标准贮备液，置4℃冰箱保存。

2.2.5 麝香草酚内标工作液：精密量取0.1 mg·mL－1的麝香草酚标准贮备液1 mL，用流动相定容于10 mL容量瓶中，摇匀，即得浓度为10 μg·mL－1的麝香草酚内标工作液，置4℃冰箱保存。

2.3 血浆样品处理

取经肝素抗凝的健康人全血适量至试管中，3000 r·min－1离心10 min，分离得到血浆样品。精密吸取空白血浆200 μL，置于10 mL具塞试管中，加入10 μg·mL－1的麝香草酚内标工作液200 μL，1%盐酸溶液2滴，涡旋混合2 min，静置30 min，加6%高氯酸乙腈溶液200 μL，涡旋混合15 min，6000 r·min－1离心30 min，取上清液置另一试管中。再加6%高氯酸乙腈溶液100 μL，涡旋混合10 min，6000 r·min－1离心10 min，合并2次上清液充分混合，取20 μL进样，作HPLC分析。

2.4 干扰试验

取空白血浆200 μL，按“2.3”项下方法处理，进样。由所得色谱图可知，在丙泊酚与麝香草酚的相应位置无干扰峰出现（色谱见图1A）。

2.5 系统适用性试验

取一定浓度丙泊酚与麝香草酚的混合标准溶液20 μL，重复进样5次，记录色谱图（色谱见图1B、C）。由图1可见，在“2.1”项色谱条件下，血浆中内源性杂质不干扰丙泊酚的测定，丙泊酚与内标峰无重叠，两者分离度＞1.5，麝香草酚与丙泊酚的理论塔板数均＞17000；保留时间分别为6.5、10.6 min；拖尾因子均在0.95～1.05范围内，符合2005年版《中国药典》的有关规定[6]。

2.6 标准曲线的制备

精密吸取空白血浆200 μL共6份，分别精密加入丙泊酚标准工作液20、100、200 μL以及丙泊酚标准稀释液100、200、300 μL，配成浓度分别为0.1、0.5、1、5、10、15 μg·mL－1的系列丙泊酚血浆溶液，再依次加入内标工作液200 μL、1%盐酸2滴，依照“2.3”项下方法操作测定，记录色谱。以丙泊酚峰面积与内标峰面积的比值（Ai/As）对丙泊酚血浆浓度（c）进行线性回归，得标准曲线方程：Ai/As＝0.0749 c+0.0054（r＝0.9999，n＝5）。结果表明，丙泊酚血药浓度在0.1～15 μg·mL－1范围内线性关系良好。

图1 高效液相色谱图A.空白血浆；B.丙泊酚标准溶液+内标工作液；C.血浆样品+内标工作液；1.麝香草酚；2.丙泊酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B propofol standard solution+thymol；C.plasma sample+thymol；1.thymol；2.propofol

2.7 回收率试验

2.7.1 提取回收率：取健康人空白血浆200 μL，分别精密加入丙泊酚标准稀释液 100、200、300 μL，制成浓度分别为 5.0、10.0、15.0 μg·mL－1的血浆样品，每种浓度各3份，按“2.3”项下方法操作，进样20 μL，测定峰面积，其结果与乙腈直接配制的同浓度的丙泊酚和内标的混合对照液直接进样所测得的峰面积相比，计算提取回收率。结果，丙泊酚低、中、高3种浓度的平均提取回收率为89.46%（n＝9），详见表1。

表1 回收率试验结果（±s ，n＝3）Tab 1 Results of recovery tests（±s ，n＝3）

表1 回收率试验结果（±s ，n＝3）Tab 1 Results of recovery tests（±s ，n＝3）

浓度/μg·mL-1 5.010.015.0 RSD/%0.240.960.39平均提取回收率/%88.22±4.90188.07±7.80692.08±6.780 RSD/%5.68.87.4平均方法回收率/%99.07±0.24099.48±0.954100.31±0.386

2.7.2 方法回收率：按“2.6”项下方法配制浓度分别为5.0、10.0、15.0 μg·mL－1的血浆样品各3 份，依照“2.3”项下方法操作，同法测定，记录峰面积。将丙泊酚与内标峰面积的比值代入血浆标准曲线方程，计算得丙泊酚的测定浓度，以丙泊酚的测定浓度与理论浓度的比值为方法回收率。结果，丙泊酚低、中、高3种浓度的平均方法回收率为99.62%（n＝9），详见表1。

2.8 精密度试验

取空白血浆200 μL 3份，分别精密加入丙泊酚标准工作液200 μL以及丙泊酚标准稀释液100、300 μL，配成浓度分别为1、5、15 μg·mL－1的丙泊酚血浆样品，按“2.3”项下方法操作，测定峰面积，每种浓度日内平行测定5次，计算日内精密度；3种浓度每天各测定1次，连续5 d，计算日间精密度，精密度试验结果见表2。

表2 精密度试验结果（±s ，n＝5）Tab 2 Results of precision tests（±s ，n＝5）

表2 精密度试验结果（±s ，n＝5）Tab 2 Results of precision tests（±s ，n＝5）

浓度/μg·mL-1 1.05.015.0 RSD/%5.505.606.60日间精密度峰面积比值0.0366±0.002720.1729±0.019000.4534±0.01867 RSD/%7.4310.904.12日内精密度峰面积比值0.0383±0.002110.1906±0.010760.46208±0.03079

2.9 最低检测限

含药血浆样品以色谱峰高相当于仪器基线噪音比3倍量进行测定，结果丙泊酚的最低检测限为0.10 μg·mL－1。

2.10 稳定性试验

取低、中、高3种浓度血浆样品，在4℃条件下分别保存1、5、10、20 d及室温放置3 h后，按“2.3”项下方法操作并进行HPLC分析，结果血浆中丙泊酚的含量无明显的改变。

3 讨论

文献报道提取血液中丙泊酚的方法主要有萃取法和沉淀法，本试验对2种方法进行了比较。在萃取法中采用环己烷为萃取剂、四甲基氢氧化铵为稳定剂，以氮气吹干有机层，流动相复溶后进样测定。结果表明这种方法操作烦琐费时，在吹干过程中药物易挥发，导致提取量与丙泊酚浓度之间不能呈现良好的线性关系，提取回收率不稳定，且有机溶剂对测定有干扰，从而影响定量分析。在沉淀法中采用6%高氯酸乙腈溶液为沉淀剂进行2次提取、涡旋混合、离心后进样分析。结果显示沉淀法较萃取法操作简单快速、方法的线性关系较好、稳定性好、准确性高，适宜于临床上血药浓度的监测。

丙泊酚是弱酸性物质，流动相组分的比例及其酸碱度直接影响丙泊酚的色谱行为，经多次试验证实以乙腈-0.01 mol·mL－1磷酸二氢钾水溶液（70∶30）为流动相，磷酸调节pH值至4.0时，麝香草酚和丙泊酚有较好的分离度，血浆的内源性物质及试剂对测定无干扰。

配制一定浓度的丙泊酚标准溶液，以流动相为空白，在200～400 nm波长范围内扫描。结果丙泊酚在270 nm波长处有最大吸收，因此选择该波长为测定波长。

[1]路丽华，张 惠，高 蓉，等.荧光检测异丙酚血药浓度[J].第四军医大学学报，2005，26（11）：86.

[2]徐 萍，房志仲，娄建石.高效液相色谱法测定人血清中丙泊酚含量[J].天津药学，2009，21（2）：22.

[3]范莹盈，徐礼鲜，文爱东，等.改良反相高效液相色谱法测定血清中异丙酚浓度[J].南方医科大学学报，2006，26（10）：1510.

[4]李庆民，潘 阳.丙泊酚的GC法测定[J].中国医药工业杂志，2000，31（8）：71.

[5]郑 宏，曹兴华，王 江，等.气相色谱-质谱法测定异丙酚的血药浓度[J].中华麻醉学杂志，2004，24（1）：71.

[6]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（二部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：附录29.