HPLC法测定脐带血中头孢美唑钠浓度及其在剖宫产产妇中的预防用药研究

王珏，魏 媛，段京莉，倪君君，熊 歆，张现化（.北京大学第三医院药剂科，北京市 009；2.北京大学医学部药学院，北京市 009；3.北京大学第三医院妇产科，北京市 009；.北京国立柏林医学科技发展有限公司，北京市 009）

头孢美唑钠是一种半合成的头霉素衍生物，抗菌性能与第2代头孢菌素相近。大量临床试验表明[1，2]，该药对革兰阳性及阴性菌均具有良好的抗菌效能，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、脆弱拟杆菌以及厌氧菌也有良好的抗菌活性，且对各种β-内酰胺酶有很强的耐受性和稳定性，可用于预防妇科、腹腔、泌尿道、呼吸道、皮肤及软组织等部位的感染。目前，头孢美唑钠广泛用于行剖宫产的产妇手术预防用药，由于头孢美唑钠可透过胎盘屏障进入胎儿血循环，而尚无数据表明本药在胎儿中的安全性，因此对头孢美唑钠在脐带血中的浓度进行测定，可以帮助考察药物对胎儿的影响。本研究建立了测定脐带血中头孢美唑钠浓度的方法，并成功地应用于临床使用头孢美唑钠预防感染的剖宫产产妇。

1 材料

1.1 仪器

1100高效液相色谱仪，包括脱气机、泵、自动进样器、G1321A柱温箱和紫外检测器（FLD）（美国Agilent公司）；GB 204型电子天平（瑞士Mettler公司）；纯水系统（美国Millipore公司）；TG16W台式高速离心机（长沙易达仪器）；MS3 digital涡旋混合器（德国IKA公司）。

1.2 试药

头孢美唑钠对照品（第一三共制药（上海）有限公司，批号：JPA0444，纯度：98%）；注射用头孢美唑钠（第一三共普乐发株式会社，批号：JPA04639-11，规格：1 g）；内标：对乙酰氨基酚对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100018-200408，含量：99.69%）；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），并配有Agilent Eclipse XDB-C184-Pack预柱（12.5 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.026 mol·L－1醋酸铵（pH 6.0）-甲醇（85∶15）；紫外检测波长：273 nm ；流速：1.0 mL·min－1；柱温：室温；进样量：20 μL。

2.2 标准溶液的配制

准确称取1 g头孢美唑钠对照品，加纯水5 mL溶解，摇匀后即得浓度为200 mg·mL－1的头孢美唑钠对照品母液，置冰箱4℃保存备用。取一定量母液加纯水，使之成为含头孢美唑钠2.5、5、10、40、100、250、500、1000 g·mL－1的系列标准溶液。

2.3 血浆样品处理

精密取血浆100 μL于1.5 mL离心管中，精密加入内标（100 μg·mL－1对乙酰氨基酚）溶液10 μL，混匀后加入甲醇300 μL，于涡旋混合器上混合2 min沉淀蛋白，再置于高速离心机以12000 r·min－1离心10 min ，取上清液100 μL于另一离心管中，加入纯水100 μL稀释，混匀后进样分析。

2.4 专属性考察

在“2.1”项色谱条件下，头孢美唑钠的保留时间约为12.8 min，内标的保留时间约为5.4 min。结果表明，药物、内标峰峰形较好，与杂质峰分离效果好，空白血浆中的内源性物质不干扰头孢美唑钠及内标的色谱分析。高效液相色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白血浆；B.空白血浆+500 μg·mL－1头孢美唑钠标准溶液+内标Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+500 μg·mL－1cefmetazole sodium+internal standard

2.5 标准曲线的制备

精密吸取系列头孢美唑钠标准溶液各10 μL，置于1.5 mL离心管中，加入空白血浆90 μL，制备成头孢美唑钠浓度为2.5、5、10、40、100、250、500、1000 μg·mL－1的血浆标准品，按“2.3”项下步骤操作并进行色谱分析，记录色谱。以头孢美唑钠浓度（c）为横坐标，头孢美唑钠峰面积与内标峰面积的比值（A）为纵坐标作图，得线性回归方程为A＝0.017c+0.083（r＝0.9994）。结果表明，头孢美唑钠血药浓度在2.5～1000 μg·mL－1范围内线性关系良好，定量下限为2.5 μg·mL－1（测得值为（2.565±0.083）μg·mL－1，RSD为3.24%）。

2.6 精密度试验

配制含头孢美唑钠5、100、700 μg·mL－1的低、中、高3种浓度的血浆样品各5份，按“2.3”项下方法操作并进样分析。在不同天内连续制备并测定3个分析批，每批样品3个浓度水平，每个浓度5份样品，计算日内、日间RSD。测定结果表明，血浆样品分析的精密度、准确度良好，结果见表1。

2.7 回收率试验

表1 精密度及回收率试验结果（n＝5）Tab 1 Results of precision and recovery tests（n＝5）

按“2.6”项下方法配制低、中、高3种浓度的头孢美唑钠血浆样品各5份，再于1.5 mL离心管中加入血浆90 μL和甲醇300 μL，涡旋2 min，12000 r·min－1离心10 min，按“2.3”项下方法操作并进样分析，并计算方法回收率。另以血浆样品头孢美唑钠峰面积与相应对照品溶液头孢美唑钠峰面积之比求算提取回收率，结果，血浆样品平均提取回收率为95.70%（RSD＝4.58%）。精密度及回收率试验结果见表1。

2.8 稳定性试验

配制低、中、高3种浓度的头孢美唑钠血浆样品，每个浓度4份，每份5个样品。第1份立即按“2.3”项下方法操作；第2份室温放置24 h后，按“2.3”项下方法操作，考察头孢美唑钠血浆样品在室温条件下的稳定性；第3份反复冻融3次，按“2.3”项下方法操作，考察头孢美唑钠在冻融条件下的稳定性；第4份在－20℃的条件下冷冻1个月，按“2.3”项下方法操作，以考察其冻存稳定性。结果显示RSD均＜9%（见表2），表明头孢美唑钠血浆样品在室温放置、冷冻储存及反复冻融情况下均稳定。

表2 头孢美唑钠血浆样品稳定性考察结果（n＝5）Tab 2 Results of stability tests of cefmetazole sodium in plasma samples（n＝5）

2.9 临床应用

11名患者均为北京大学第三医院妇产科2010年7－10月住院行剖宫产术的产妇。术前单次给予注射用头孢美唑钠2 g，静脉滴注0.5 h，于给药后不同时间点取脐带血于抗凝管中，用高效液相色谱（HPLC）法测定脐带血中头孢美唑钠浓度，结果见表3。

表3 11例剖宫产产妇取血时间及血药浓度Tab 3 Blood sampling time and plasma concentration in 11 patients with cesarean section

3 讨论

3.1 测定方法的优化

本研究建立了测定人血浆中头孢美唑钠浓度的HPLC法，并进行了系统的方法确证，结果表明该方法稳定性良好，符合生物样品分析的要求。

在建立本定量分析方法时，本研究对流动相的pH值、流动相组成的比例、紫外检测波长等分析条件进行了优化。流动相醋酸铵和甲醇的比例为85∶15，醋酸铵pH值为6.0，此结果是在参考相关文献的基础上[3～7]，通过测定组分的不同比例，并以醋酸调节其pH值，考察其不同条件下目标成分及内标的峰形和保留时间进行优化而得。另外分别测定了头孢美唑钠在213、254、273 nm波长下的紫外吸收情况，为最大限度地提高其响应值，最终选定273 nm为检测波长。

本研究建立的方法操作简便、回收率高、专属性强、稳定性好，结果准确、灵敏、快速，为检测头孢美唑钠的血药浓度提供了简单可行的方法，还可用于头孢美唑钠的治疗药物监测和药动学的研究。

3.2 临床应用

剖宫产切口属于Ⅱ类切口，手术主要感染病菌为革兰阴性杆菌，多使用第2代头孢菌素。头孢美唑钠疗效与第2代头孢菌素类似，且具有头孢菌素类药物抗菌谱较广、疗效肯定、价格低廉的优点[8]。

研究表明[9]，健康成年人静脉滴注注射用头孢美唑钠1 g 1 h后，血药浓度在滴注结束时达峰值，峰平均值为76.2 μg·mL－1，6 h后为2.7 μg·mL－1，血药浓度半衰期为1.2 h左右，药物浓度和给药剂量成正相关。另有一项由高濑善次郎等[8]进行的静脉注射1 g头孢美唑钠后30 min～6 h测定母血和脐带血浓度研究中，母体血清中的药物浓度在给药后30 min达峰，平均峰值为98 μg·mL－1；脐带血清在2 h后达峰，峰值为12.25 μg·mL－1。表明母体血清和脐带血清中的药物浓度达峰时间存在1.5 h的时间差，从峰值的比率来看，母体血清浓度有12.5%渗透至脐带血清中。

本项研究中头孢美唑钠给药剂量为2 g，滴注时间为30 min。剖宫产术时胎儿娩出时间普遍为开始用药后的15～20 min，此时脐带血中头孢美唑钠浓度约为10～16 μg·mL－1。与文献相比，血药浓度仅相当于母体浓度的7%～10%。从11例剖宫产产妇不同时间点所取血测得的结果可以看出（见表3），脐带血中的头孢美唑钠浓度大约在45 min～1 h左右达到峰值，约23～25 μg·mL－1。因药物浓度与给药剂量成正相关，此结果与文献中给予1 g药物静脉滴注时的峰浓度值12.25 μg·mL－1一致，约相当于母体血峰值的12%。还需注意的是，严重肾功能损害者可能会出现血药浓度升高、半衰期延长。本项研究中的患者肾功能均无异常，而对于肾功能不全的剖宫产产妇要慎重用本药，适当调节给药剂量和间隔。

虽然头孢美唑钠被证实是一种疗效较好的药物，尤其是其对β-内酰胺酶有很好的稳定性[10，11]，然而随着耐药性革兰阴性杆菌的逐渐增加，有必要进行更加深入的临床研究，以确立本药对新生儿和产妇的安全性。

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