莼菜传粉生物学及杂交技术研究

2011-05-22李双梅柯卫东叶元英黄来春

中国蔬菜 2011年12期

李双梅柯卫东叶元英黄来春

（武汉市蔬菜科学研究所，湖北武汉 430065）

莼菜（Brasenia schreberi J.F.Gmel）为睡莲科（Nymphaeaceae）莼菜属（Brasenia schreb.）多年生水生草本植物，苏联、日本、印度、美国、加拿大、大洋洲东部及非洲西部均有分布（中国科学院中国植物志编辑委员会，1992）。研究莼菜的花器官结构和传粉系统对于杂交育种及种质创新有着重要的意义。

近年来，部分国外学者对莼菜的研究日趋深入，在分子遗传及花粉个体发育学等方面做了大量工作（Taylor & Osborn，2006；Kim et al.，2008），国内学者在莼菜的解剖、加工、栽培、遗传多样性、胚胎学、细胞学及营养成分等方面研究较多（常福辰等，1996；吕家龙等，1996；丁春邦等，1997；李焕秀等，1997；施国新等，1999；袁政等，2007；张光富和高邦权，2008），而有关其传粉生物学的研究鲜见报道。传粉生物学是研究与传粉有关的各种生物学特性及其规律的学科（黄双全和郭友好，2000）。本试验以利川莼菜为材料，对花器官的结构、开花习性、花粉的活力、柱头可授性、传粉方式等进行研究，旨在揭示莼菜的开花传粉习性，并提出莼菜人工杂交方法。

1 材料与方法

1.1 供试材料

于2008年5月6日～6月10日对国家种质武汉水生蔬菜资源圃的利川莼菜进行观测，观测面积为1333 m2，正常田间管理。

1.2 试验方法

1.2.1 群体花期与开花习性群体花期观测：莼菜第1朵花开放的日期为始花期，50 %的莼菜水中茎开花的日期为盛花期，最后一朵花开放的日期为终花期，花期观测面积为66.7 m2。

对于同一短缩茎上不同分枝抽生花芽的节位，随机选取 10个完整的植株，分别记录第 1分枝、第2分枝和第3分枝抽生花芽的起始节位。对于单个分枝开花朵数及同一分枝每朵花开放间隔的天数，随机挂牌10个分枝，分别记录每朵花开放的时间，最后统计开花朵数和开花间隔天数。

观察单朵花的开花规律：随机选取 10个刚现蕾的花挂牌标记，每天观察并记录，直至花凋谢。观察时记录单朵花从现蕾到开花所需天数、开花天数、开花期间每天开放时间和闭合时间、雌雄蕊的伸长规律以及散粉时间等。

花器官性状观察：早上8:30随机选取30朵第1天开放的花挂上标签，分别观测花柄出水高度、萼片长/宽、花瓣长/宽、花药长、花丝长、雌蕊长、花冠直径、雄蕊数量和雌蕊数量。第 2天早上8:30再次对以上30朵花的器官性状进行观测。

1.2.2 杂交指数（Outcrossing index，OCI）的估算按照Dafni（1992）的标准对花直径及开花行为进行观测及繁育系统的评判。具体方法：① 花朵或花序直径＜1 mm记为0；1～2 mm记为1；2～6 mm记为2；＞6 mm记为3。② 花药开裂时间与柱头可授期之间的时间间隔，雌雄蕊同熟或雌蕊先成熟记为0；雄蕊先成熟记为1。③ 柱头与花药的空间位置，同一高度记为0；空间分离记为1。①、②、③ 之和为OCI值。评判标准：OCI=0时，繁育系统为闭花受精；OCI=1时，繁育系统为专性自交；OCI=2时，繁育系统为兼性自交；OCI=3时，繁育系统为自交亲和，有时需要传粉者；OCI=4时，繁育系统为部分自交亲和，异交，需要传粉者。

1.2.3 同一分枝不同节位花自然结实的观测种子成熟期，随机选取10个分枝，分别观测不同节位花的花柄长、心皮数和结实数。

1.2.4 花粉生活力的测定（MTT法）与花粉/胚珠（P/O）估算花粉生活力的测定：5月 30日选取10朵花，插入30 mL的试剂瓶（装水）中，置于室内20 ℃环境中，从散粉至衰败（1 h、2 h、3 h、4 h、8 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、11 d）定期取花粉测定。花粉样品置于载玻片上，加1～2滴1 % MTT溶液，加盖玻片后置于低倍镜下观察。每个制片观察5个视野，共统计100粒左右，染成深红色、红色的花粉计为有活力，浅红色、无色的计为无活力，计算花粉的活力百分率。3次重复，取平均值。

花粉/胚珠（pollen ovule ratio，P/O）估算：随机选取即将开放的花蕾（花药未开裂）20朵，固定于FAA中备用。剥开花瓣切下所有花药，用1.0 mL·L-1HCl软化花药壁，解剖花药，将全部花粉移入一个有刻度的离心管，仔细清洗花药壁、镊子和刀片，清洗液也移入离心管，定容至2 mL，振荡器下振荡60 s，制成花粉粒悬浮液，用微量进样器取2 μL花粉液于载玻片上，在显微镜下观察并统计花粉数，3次重复，取其平均值乘1000算出每个单花蕾的花粉粒总数（王英强等，2005）。接着将该花蕾的子房置于载玻片上于解剖镜下解剖剥离，统计胚珠数。计算花粉/胚珠（P/O）。依据Cruden（1977）的划分标准：P/O为18.1～39.0时，繁育系统为专性自交（Obligate autogamy）；P/O为31.9～396.0时，繁育系统为兼性自交（Facultative autogamy）；P/O为244.7～2588.0时，繁育系统为兼性异交（Facultative xenogamy）；P/O为2108.0～195525.0时，繁育系统为专性异交（Obligate xenogamy）。

1.2.5 人工套袋授粉设6种授粉处理：自然授粉，去雄套袋，不去雄套袋，去雄不套袋，第1天开放花的异花人工授粉，第2天开放花的异花人工授粉。每个处理随机选择30朵花，采用白色硫酸纸袋套袋，统计不同处理的结实率。

2 结果与分析

2.1 花部特征及开花习性

莼菜群体花期为5月初～6月初，主要集中在5月10～30日。完全花，花冠轮状红色，花瓣3枚，萼片3枚，雄蕊22～34枚，雌蕊6～12枚，单个子房胚珠数2个，一般一个胚珠发育成种子，另一个胚珠退化（所占比例92.8 %），极少数子房的2个胚珠都发育成种子（所占比例7.2 %）。

花一般在早上5:00～9:00陆续开放，10:00以后逐渐闭合，至12:00花全部闭合。莼菜雌雄同花，雌蕊先成熟。花开放第1天，花柄伸出水面，花被逐渐张开，并向外反卷，花刚开放时雌蕊高于雄蕊，雌蕊群紧密包合，后成辐射状张开，柱头上有细毛状物，白色，利于接受花粉；此时，雄蕊群尚未成熟，花药表皮呈红色，不开裂，位于雌蕊柱头之下。10:00以后，雌蕊合拢，花被逐渐收拢闭合，花梗微微弯曲。雄蕊在花闭合状态下逐渐伸长，雄蕊的伸长主要是花丝的伸长，而花药的长度变化不大。第2天花开放时，花梗再次挺立，此时花朵离水面高达3 cm，花被再次张开并反卷，雌蕊合拢，雄蕊高出雌蕊0.5 cm左右，呈辐射状，花药纵向开裂，大量散出浅黄色花粉。10:00以后花逐渐闭合沉入水中。第3天，花不再开放。

从莼菜短缩茎的不同节位上抽生分枝（水中茎），不同节位上的分枝第 1花芽着生节位是不同的。一般而言，第1分枝在第11节开始分化花芽，第2分枝则在第7节分化花芽，第3分枝在第5节分化花芽，每个短缩茎一般抽生5～6条水中茎。莼菜单条水中茎开花4～5朵，少数6朵，花着生叶腋部。各条水中茎单朵花开花间隔3～4 d，一般从下往上顺序开放。现蕾到开花约需17 d，单朵花花期2 d。从受精完成到种子成熟需45 d左右。

2.2 莼菜的杂交指数（OCI）

根据调查结果，莼菜的花冠直径超过6 mm，可以计为3；莼菜是雌蕊先成熟，应计为0；柱头与花药之间空间分离明显，应计为1。因此，莼菜的杂交指数为4，根据Dafni（1992）的标准，莼菜的繁育系统为部分自交亲和，异交。

2.3 花器官性状的动态观察

从表1可知，第2天开放的花，其花柄出水高度、萼片长度、花瓣长度、雄蕊长度、花丝长度及花冠直径都大于第1天开放的花，而萼片宽度、花瓣宽度、雌蕊长度和花药长度均没有变化。第1天雄蕊高度低于雌蕊，第2天雄蕊明显高于雌蕊，花药开裂利于传粉。

表1 花器官数量性状动态观察统计结果 cm

2.4 同一分枝不同节位花自然结实情况

由表2可知，第1朵花的花柄最长，其他部位花的花柄长度依次变短，花柄的长短与开花节位到水面的高度有关。第3朵花和第4朵结实心皮的比例较高，其他部位花结实心皮的比例较低，这可能是前期气温较低而后期气温又较高造成的。

表2 同一分枝不同节位花自然结实率

2.5 花粉生活力的动态变化及花粉/胚珠（P/O）

由表3可知，花粉活力在散粉初期（1～3 h）无明显变化，在第1天内都保持83.5 %以上，到第2～3天开始慢慢下降，第4～5天后明显下降，第10天后为0，完全失去活力。

每朵花的花粉数为239700～296000粒，而每朵花的胚珠数为 14～22个，莼菜花的 P/O值平均为14947，依据Cruden（1977）的划分标准确定莼菜的繁育系统为专性异交。

表3 同一朵花散粉后不同时间的花粉活力变化

2.6 莼菜花的人工授粉

由表4可知，莼菜花去雄套袋和不去雄套袋两个处理，结实率均为 0，表明莼菜花不存在无融合生殖现象，而自然授粉结实的花朵比例为72.3 %，结实心皮的比例为20.9 %，表明莼菜为异花授粉作物。

人工授粉（第1天开放的花）结实的花朵比例为95.2 %；结实心皮的比例为27.8 %，均高于自然授粉，其中结2粒种子的心皮所占比例为2.0 %，结1粒种子的心皮所占比例为25.8 %；胚珠发育成种子的比例为14.8 %。去雄不套袋结实的花朵比例为70.0 %，结实心皮的比例为14.5 %，略低于自然授粉的情况。

表4 莼菜花不同授粉处理的结实率

第2天开放的花人工授粉结实的花朵比例仅为18.2 %，结实心皮的比例为1.7 %，较第1天开放的花授粉结实率降低了很多，表明莼菜花柱头的可授期主要在第1天，第2天的花柱头可授性大大降低。

2.7 莼菜杂交技术

① 套袋。套袋时应保证父本套袋的花较母本套袋的花提前一天开放。一般应选取生长饱满的花蕾，大小为9 mm×6 mm左右。套袋时用0.05 mm厚的硫酸纸袋，大小为10 cm×8 cm。② 采粉。对已套袋的父本花，取开放第2天（花粉刚刚散开）的花粉，装入圆形带盖的铝盒中备用。③ 去雄授粉。选取母本中套袋第 1天开放的花，先用镊子去除雄蕊，然后用毛笔将已采的父本花粉散到柱头上，再用硫酸纸袋套住，以防其他花粉污染柱头。④ 去套袋。授粉3 d后，应除去所套硫酸纸袋，同时将花摁入水中。⑤ 种子采收。莼菜种子在授粉后50～55 d成熟，成熟种子为黄褐色，此时即可采收。采收后的种子应浸泡水中。

3 讨论

本试验使用 P/O、OCI两个参数对莼菜的繁育系统进行检测，检测后的两个参数结果一致，表明莼菜的繁育系统为专性异交型。莼菜开花第1天，雌蕊成熟，柱头高出雄蕊，其上有细毛状物，白色，利于接受花粉，柱头具有可授性；第2天花药才开裂散粉，在自然情况下，柱头第2天是可授粉的（人工授粉结实心皮的比例为1.7 %），因此不能排除有自花授粉的情况发生，但人工套袋自交中没有结实现象，也可能是套袋过程中纸袋被水浸湿，导致雄蕊不能正常散粉。

根据套袋结果显示，去雄套袋的结实率为 0，说明莼菜没有无融合生殖现象；自然授粉结实心皮的比例为20.9 %，低于人工异花授粉（第1天的柱头）结实心皮的比例（27.8 %），这可能是莼菜主要依靠风来传粉，从而造成传粉不足导致的。另外，去雄不套袋结实心皮的比例（14.5 %）低于自然授粉结实心皮的比例（20.9 %），这可能是去雄时对花造成了一定的伤害而导致的结果。

莼菜是我国的一种特色水生蔬菜，由于对水质和环境要求较高，只能在特定的地区栽培，对其传粉生物学和种子生物学缺乏研究，通过传粉生物学和种子生物学的研究（种子生物学研究将另文介绍），对于莼菜的资源保护、种质创新和杂交育种具有重要意义。

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