黄瓜耐低氮基因型的筛选及遗传分析

于明磊 秦智伟 徐静静 周秀艳

（东北农业大学园艺学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

氮素是植物生长过程中所必需的大量元素之一，也是作物生长的重要限制营养元素。在自然环境里，即使是氮素利用率很高的作物，也不可能总是吸收到足够多的氮。因此为了提高作物的产量，需要施用一定量的氮肥。据估计，化肥对世界粮食增产的贡献率高达40 %～60 %（王艳朋等，2007），氮肥对增产的重要性不言而喻。

黄瓜（Cucumis sativus L.）是全球消费量最多的十类蔬菜之一。黄瓜喜水喜肥，对肥料尤其是氮肥的需求量大。为了提高产量，黄瓜生产中施氮量普遍过高。氮肥的过量施用不仅造成了农业生产成本的显著提高，还引起了黄瓜果实品质和食用安全性的降低，而且氮肥通过各种途径大量流失还带来了严重的环境问题（徐志远，2006）。目前，在黄瓜生产上人们试图通过控制和减少氮肥的施用量来实现绿色、无公害的生产目标，但产量受到一定程度的影响。选育具有耐低氮特性的黄瓜新品种，是减少黄瓜生产中氮肥施用量最有效和最简捷的手段（Yu et al.，2004）。因此，本试验旨在确立黄瓜耐低氮性种质资源鉴定标准，筛选耐低氮种质资源，并进一步探明黄瓜耐低氮性的遗传规律，以期为选育耐低氮性强的黄瓜新品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参照东北农业大学黄瓜课题组徐志远（2006）的试验结果，选用津研4号、635、649、F02-07、04-1-4、129-1、D0401、D0327、D0317、D0328、D0420、D0422、D0432、D0435 和 HL-3 等 14个黄瓜品种（自交系）为试材，供试材料均由东北农业大学黄瓜课题组提供。

1.2 供试基质

试验所用培养基质是由土壤、蛭石和河沙按20 m∶5 m∶1 m混匀而成，密度为1.0～1.3 g·cm-3，该密度有利于黄瓜根系的生长和对营养的吸收。其中土壤取自东北农业大学园艺学院园艺站大田耕层土壤，过筛去除其中的硬块和草屑。培养基质的基础肥力为全氮 0.202 %，全磷0.167 %，有机质4.374 %，碱解氮127.9 mg·kg-1，缓效钾920.5 mg·kg-1，速效钾166.0 mg·kg-1，速效磷 142.0 mg·kg-1，pH 7.34。

1.3 试验设计

采用混合基质盆栽法，选用规格为30 cm×25 cm的瓦氏桶，每盆装混合基质13 kg。共设2个施氮水平：不施氮和正常施氮〔N 40 kg·（667 m2）-1〕。氮肥采用尿素，磷肥和钾肥选用过磷酸钙和硫酸钾，P2O5和K2O施用总量分别为41.5 kg·（667 m2）-1和23.3 kg·（667 m2）-1。施肥分4个时期：苗期、抽蔓期、结瓜初期、结瓜盛期。苗期每隔2 d灌溉1次，每次用水量为0.5 L·桶-1；定植后每隔2 d灌溉1次，每次用水量为1 L·桶-1；结实后每隔1 d灌溉1次，每次用水量为1.5 L·桶-1。全生育期内叶面喷施微肥2次。

筛选试验：供试的 14个品种自南向北依次排列，采用随机区组设计，每个品种的每种施肥方式设5次重复。各个品种在盛果期（播种后102 d）取样进行各项指标的检测，每个指标进行5个平行试验，去除2个偏离较大的数据后取均值作为检测结果。

遗传规律分析群体的构建：选用筛选试验所得的耐低氮性最弱和最强的品种，分别作母本（P1）和父本（P2）进行杂交，得到 F1群体，将 F1单株自交获得 F2。将 F1分别与两个亲本回交，获得BC1P1（简称B1，40株）和BC1P2（简称B2，40株）两个回交世代。同时盆栽P1（20株）、P2（20株）、F1（20株）、F2（200株）和B1（40株）、B2（40株），即可获得六世代联合分析群体。所有单株在盛果期同时取样进行耐低氮性检测。试验于2009年3月～2010年12月在东北农业大学园艺试验站温室内完成。

1.4 检测项目

筛选试验所需检测的指标，包括两个施氮水平下各个品种的5个形态学指标（株高、茎粗、叶面积、叶柄长和根体积）和5个生理生化指标〔生物量、叶绿素a含量、叶绿素b含量、硝酸还原酶活性（NRA）和总含氮量〕。遗传规律的分析群体只分析叶绿素b含量。

1.4.1 土壤肥力检测 供试土壤基础肥力的7项指标测定方法参照南京农业大学（1988）的土壤农化分析方法进行：土壤有机质测定采用电砂浴加热-K2Cr2O7法，土壤碱解氮测定采用碱解扩散法，土壤速效磷测定采用NaHCO3浸提-钼锑抗比色法，土壤速效钾测定采用NH4OAC浸提-火焰光度法，土壤pH测定采用电位法，土壤全氮测定采用H2SO4-H2O2消煮-蒸馏法，土壤全磷测定采用H2SO4-H2O2消煮-分光光度法，土壤全钾测定采用H2SO4-H2O2消煮-火焰光度法。

1.4.2 形态学指标检测 产量：黄瓜植株开始结实后，每隔1 d采摘商品成熟的黄瓜果实1次，所得果实用电子天平称量。株高：去除根和叶片后，用直尺测量子叶基部至植株顶端的长度，即为株高。茎粗：用游标卡尺分别测量植株底部（第 3～4节）、中部（第 11～12节）和顶部（第23～24节）的茎粗，每个部位重复测量3次，取均值；然后将各个部位茎粗取平均值即得植株茎粗。叶面积：用直尺测量植株发育成熟的叶片（即最大叶片）的长和宽，并根据公式计算出黄瓜叶面积，黄瓜叶面积＝0.743×叶片长×叶片宽（裴孝伯 等，2005）。叶柄长：用直尺测量发育成熟的叶片从叶腋到叶柄与叶片上表面连接点的长度，即为叶柄长。根体积：将根系浸没在装满水的溢流器中，并用量筒称量所排出水的体积，即为根体积。

1.4.3 生理生化指标检测 生物量是将植株（包括果实）80 ℃烘干后，用1/100电子天平称量所得；叶绿素a、b的含量（〔Ca〕、〔Cb〕）是盛果期采样后，用95 %乙醇/分析纯丙酮（1 V∶1 V）浸提24 h，并用分光光度法检测；硝酸还原酶活性（NRA）测定采用活体法（郝再彬 等，2004）；总含氮量测定采用凯氏定氮法（郝再彬 等，2004）。

1.5 数据分析

用 Excel软件进行正态分布检验，绘制频率分布图。采用 Hayman分析法进行遗传分析，采用Gill等和Griffing的方法估算遗传力（盖钧镒 等，2002），其他数据处理采用Excel 2003完成。

测量结果得到各世代平均数后，为判定加性-显性遗传模型对黄瓜耐低氮性的研究是否适合，采用ABC尺度检验法。并通过t测验分析其显著性。A、B、C检测结果若符合加性-显性模型，均应为0；若不符合加性-显性模型，即存在上位效应，则不等于0，因而可对A、B、C中任一值进行t测验，Mather和Jinks也称以上判断模型的相符性为尺度测验（郝再彬 等，2004）。

其中，VD属于加性方差部分，是可固定遗传的；VH属于显性方差部分，不能固定遗传；VE表示非遗传的环境方差；n表示代数。

2 结果与分析

2.1 氮肥吸收率、氮素利用率和耐低氮指数与各指标之间的相关性分析

正常施氮条件下，对所检测的〔Ca〕、〔Cb〕、NRA、总含氮量、生物量、茎粗、株高、叶柄长、叶面积和根体积10个指标之间，以及各指标与耐低氮指数间进行相关性分析，结果如表1所示。

从表1中可以看出，〔Ca〕和〔Cb〕与耐低氮指数的相关性极为显著，表明黄瓜耐低氮性与叶绿素含量紧密相关；NRA与耐低氮指数有一定的关系，但未达到显著水平，与Zieserl等（1980）所指出的叶片中NRA可以作为氮代谢、产量和蛋白质含量的选择指标观点相一致；〔Ca〕和〔Cb〕间，植株总含氮量与生物量间，以及茎粗和叶面积间的正相关性均达到了极显著水平；而叶柄长与〔Ca〕和〔Cb〕间的负相关性，以及根体积和株高间的正相关性也达到了显著水平。显然，黄瓜的各指标之间，以及耐低氮性与各指标间均存在着一定的关联。

表1 正常施氮条件下各指标以及耐低氮指数之间的相关性分析

2.2 主要指标对耐低氮指数的通径分析

为了进一步明确各种指标对耐低氮指数的作用，本试验还进行了各指标对耐低氮指数的通径分析。由表2中可以看出：〔Cb〕对耐低氮指数的直接贡献最大，且显著高于〔Ca〕对耐低氮指数的直接贡献。但由于主要受到〔Ca〕对耐低氮指数的间接贡献为负值的影响，使得〔Cb〕和耐低氮指数的相关系数与〔Ca〕接近。

〔Ca〕对耐低氮指数的直接贡献的绝对值仅次于〔Cb〕。但它通过〔Cb〕对耐低氮指数的正向间接贡献抵消了其负向直接贡献，因此它与耐低氮的相关性表现为正相关。

总含氮量、茎粗和叶柄长对耐低氮指数的正向直接贡献均较大，其中受到〔Cb〕和生物量对耐低氮指数有较高的负向影响，总含氮量和耐低氮指数的相关系数未达到显著水平；茎粗则受到叶柄长和叶面积所引起的负向作用影响，因而和耐低氮指数的相关系数较低；叶柄长与耐低氮指数呈较低的负相关关系，则主要是由于〔Cb〕的负向间接作用较高所致。生物量对耐低氮指数的负向直接贡献也达到了极显著水平，但由于总含氮量所引起的正向贡献略高于其正向贡献，因此它与耐低氮指数间的相关系数较低。

其他各指标对耐低氮指数的直接贡献均未达到显著水平。

通径分析综合表现为各项指标对与耐低氮指数的直接贡献绝对值大小依次为：〔Cb〕＞〔Ca〕＞总含氮量＞生物量＞茎粗＞叶柄长＞NRA＞叶面积＞株高＞根体积。综合考虑各指标与耐低氮指数的相关程度和对耐低氮指数贡献的大小，选用〔Cb〕作为黄瓜耐低氮性的筛选指标。

表2 主要指标对耐低氮指数的通径分析

2.3 黄瓜耐低氮性遗传规律初探

2.3.1 耐低氮品种筛选 根据各个品种叶片内的〔Cb〕检测结果，对黄瓜品种资源的耐低氮性进行显著性分析。从表 3中可以看出，D0328、津研4号和D0435叶片中〔Cb〕较高，其中D0328最高；D0422和 F02-07，04-1-4叶片中〔Cb〕较少，尤其D0422叶片中的〔Cb〕最少，故选取〔Cb〕差距最大的D0328和D0422作为杂交亲本进行遗传分析试验，两个亲本叶片中〔Cb〕的差异达到了极显著水平。

2.3.2 六世代联合遗传分析

2.3.2.1 F2群体正态性分析 为检验 D0422×D0328的 F2群体的正态性，对 F2群体的耐低氮性进行D’Agostino检测，结果表明Y=-3.11>Y0.01/2=-3.30，表明 F2群体的耐低氮性基本符合正态分布，但不显著，需进一步通过峰度和偏度进行正态性验证。

进一步检验了F2群体的分离度，并通过峰度和偏度对F2单株的〔Cb〕进行定性正态性检验。结果见图1。

正态性检验结果表明：峰度值=-0.188，偏度值=0.064，二者绝对值均小于1。说明D0422×D0328的F2频度分布符合正态分布。F2的频度分布图呈正态分布，说明黄瓜耐低氮性是多基因控制的数量性状。应用数量性状遗传学对黄瓜耐低氮性进行遗传分析是可行的。

2.3.2.2 遗传模型分析 统计六世代（P1、P2、F1、F2、B1和 B2）各个单株叶片内的〔Cb〕，并统计其样本容量、样本平均数和方差。所得结果见表4。

ABC尺度遗传检验结果如下：

A尺度测验：A=1.456，δA2=18.579，δA=4.310，t=A/δA=0.338，df=200，t0.05=1.62。

B 尺度测验：B=0.032，δB2=16.053，δB=4.007，t=B/δB=0.008，df=200，t0.05=1.62。

C 尺度测验：C=0.664，δC2=97.226，δC=9.860，t=C/δC=0.067，df=200，t0.05=1.62。

由以上遗传检验可知，组合D0422×D0328耐低氮性经ABC尺度检测，其测验结果差异均不显著，即A=B=C=0，说明该性状符合加性-显性遗传模型，同时也说明可以应用加性-显性遗传模型对黄瓜进行黄瓜耐低氮性遗传研究。

2.3.2.3 遗传力、加性效应和显性效应分析 本试验结合六世代对黄瓜耐低氮性进行了遗传检验，确定黄瓜耐低氮性的遗传模型符合加性-显性模型，上位作用方差VI=0，进而将上述 F2世代的总表型方差可以分解为遗传方差和环境方差两部分。

表3 叶绿素b含量差异显著性分析

图1 D0422×D0328的F2群体叶片中〔Cb〕的频度分布

表4 六世代样本容量、样本平均数和方差

平均显性度<1表明，黄瓜耐低氮性非完全显性遗传，其加性效应较显著，显性效应较小，但不可忽略。广义遗传力和狭义遗传力均较高，说明黄瓜耐低氮性的遗传受环境影响较小，而且主要是由基因加性效应所控制。广义遗传力明显大于狭义遗传力，说明存在显性遗传效应。但环境方差在F2世代总表型方差中所占比例低，也证实了显性效应未占主导地位，环境效应可忽视。在严格控制环境条件前提下，理论上可以在早期世代就根据单株的表现型进行选择，而且能比较正确地判断其基因型。黄瓜耐低氮性基因遗传的分量比重大，因此能把黄瓜耐低氮性稳定地传递给以后各世代群体。

3 结论

传统的耐低氮性筛选指标（如耐低氮指数），因其结果的获得常常需要同时检测同一指标在两种不同施氮条件下的数值，不仅费时费力，而且不能实现对分离群体的耐低氮性的分析。所有形态学指标和生理生化指标中，叶绿素a和叶绿素b含量这两个指标与耐低氮指数显著相关。通径分析结果表明，叶绿素b含量对耐低氮指数的贡献最大，综合分析后确定叶绿素b含量为黄瓜耐低氮性的最佳筛选指标。

以叶绿素 b含量为筛选指标，得到耐低氮性最强和最弱的两个黄瓜品种分别为 D0328和D0422。并利用D0422×D0328构建六世代联合遗传分析群体以研究黄瓜耐低氮性的遗传规律。

F2群体呈正态性表明黄瓜耐低氮性为数量性状；较大的广义遗传力和狭义遗传力表明黄瓜的耐低氮性主要取决于基因型。黄瓜耐低氮性的遗传主要以加性效应为主，显性效应较小。因此可充分利用基因的加性效应，在不同自交系上逐步累加高黄瓜耐低氮性基因，然后自交系之间配制杂交组合，最大限度地利用显性效应。因此采用常规育种法获得黄瓜高耐低氮性新品种是可行的。

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