柑橘花药试管愈伤诱导技术

罗君琴，徐建国，王 平，柯甫志，聂振朋

(浙江省柑橘研究所，浙江 黄岩 318020)

花药离体培养技术在作物育种和遗传进化研究中具有重要的理论和应用价值，利用该技术可获得一定比例的单倍体或异倍体材料，有助于在短期内创造新的不同基因型的遗传材料，丰富作物育种原始种质资源，有助于缩短育种进程［1-11］。

本研究选择柑橘单核中晚期花药为离体培养外植体［7-8］，通过比较不同柑橘品种［2］、培养基外源激素配方［3，8-9，12-15］、外植体低温预处理［3，7-8，12］等因子对花药离体愈伤诱导的影响，研究柑橘花药离体愈伤诱导及无菌再生体系的建立，以期为今后全面开展柑橘花药 (花粉)离体培养奠定一定的技术基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以浙江省柑橘研究所山地试验站品种资源圃及本部试验场的北京柠檬 (Citrus limon Burm.f.)、439桔橙 (reticulata× sinensis)、早桔 (Citrus compressa Tanaka)、四季桔 (madurensis Lour.)和长寿金柑(Fortunella obovata Tanaka)5个柑橘品种为试材，以柑橘现蕾期花粉处于单核中晚期时的幼花蕾花药为离体培养对象。

1.2 外植体消毒

先将柑橘幼花蕾在洗涤剂中浸泡15～30 min，流水冲洗20～30 min，在无菌条件下，将花蕾进行75%乙醇10～15 s+0.1% 升汞10 min 灭菌处理，无菌水冲洗3～5 次后，在体视显微镜下切除花丝，小心切取花药接种到各诱导培养基上，接种时注意避免花柱、花冠、子房等其他组织器官混入。

1.3 试验设计

1.3.1 不同柑橘品种花药离体愈伤诱导比较

试验比较北京柠檬等5种柑橘花药在相同培养条件下离体愈伤诱导效果。每个品种离体接种500个以上花药，花药接种后每隔1 周观察愈伤形成情况，记录各品种花药最早愈伤出现时间，3个月后统计产生愈伤接种外植体比例。

1.3.2 外源激素对柑橘花药愈伤诱导的影响

以MT 基本培养基中添加6-BA，TDZ，2，4-D为考查因子，利用正交设计筛选花药愈伤诱导培养基外源激素配方。试验以北京柠檬花药为接种外植体，采用L9(33)正交方案，设9个处理组合，每个处理组合接种400～500个花药，培养3个月后，观察记录花药愈伤诱导情况，统计分析外源激素对花药愈伤诱导的影响。

1.3.3 低温预处理对柑橘花药愈伤诱导的影响

柑橘花药外植体接种于相同愈伤诱导培养基上，先分别在 (6 ± 2)℃低温暗培养0，5，10，15，20 d，再转入23～25℃条件暗培养。每处理400～500个花药，3个月后观察统计产生愈伤外植体比例。以上各处理基本培养基均为MT+30～40 g·L-1蔗糖+8 g·L-1琼脂，pH 值5.8，培养温度无特指均为23～25℃，光照条件为愈伤产生前为暗培养，愈伤形成后在2 000～2 500 lx 下12 h·d-1光培养。

2 结果与分析

2.1 不同柑橘品种花药离体愈伤诱导比较

从表1 可知，北京柠檬花药愈伤较易诱导，花药愈伤最初产生所需时间在5个柑橘品种中最短，5 周即肉眼可见愈伤产生，接种后花药产生愈伤外植体比例极显著高于其他几种，高达69.97%。439 桔橙、长寿金柑、四季桔花药愈伤诱导较难，花药接种3个月后外植体愈伤比率仅分别为1.90%，0.33%和0.20%。早桔接种后3个月内未能获得花药愈伤，接种23 周后才有愈伤产生，其花药愈伤诱导在5个供试品种中最难。柑橘花药离体接种及所获诱导愈伤的部分组培图片如图1所示。

表1 5个柑橘品种花药离体愈伤诱导

2.2 不同外源激素对柑橘花药愈伤的诱导

图1 几种花药离体培养形成的愈伤组织

北京柠檬花药离体培养3个月后，观察比较各处理培养基对花药愈伤诱导的影响 (表2)。对6-BA，TDZ 和2，4-D 3个水平、9个组合试验结果进行极差分析表明，3种外源激素对花药愈伤诱导的影响作用依次为2，4-D ＞TDZ ＞6-BA;对试验数据进行方差分析表明，2，4-D (F=10.34)，TDZ (F=1.63)，6-BA (F=0.29)等因子对北京柠檬花药愈伤诱导影响均未达显著水平。结合表2直观分析，试验可优选处理2 组合培养基用于柑橘花药愈伤诱导培养。

表2 外源激素对北京柠檬花药愈伤诱导的影响

2.3 低温预处理对柑橘花药愈伤诱导的影响

北京柠檬、439 桔橙花药接种前分别在 (6 ±2)℃低温暗培养0，5，10，15，20 d，各处理花药接种3个月后，进行外植体产生愈伤比例观察(图2)。

图2 低温预处理时间对柑橘花药愈伤诱导的影响

由图2 可知，2种柑橘在 (6 ±2)℃低温预处理5～10 d，花药外植体愈伤诱导比率均高于未低温预处理及低温预处理超过15 d 的处理。适当时长的低温预处理有助于柑橘花药离体愈伤诱导。

3 小结和讨论

相同诱导培养基和光温控制条件下，5个供试柑橘品种花药愈伤诱导差异很大，一定程度上反映出柑橘花药诱导受各品种不同的遗传因子直接影响。品种选择是柑橘花药愈伤诱导成败的关键。结合郑振光等［8］的柑橘花药培养研究表明，柠檬类、橙类花药的离体愈伤诱导相对较易，宽皮柑橘类栽培品种花药愈伤诱导较难。试验中的长寿金柑、四季桔均是金柑与宽皮柑橘的杂种后代，两品种的花药离体愈伤最初产生所需时间及花药接种3个月后的外植体愈伤比例很接近，这也反映出遗传基因决定柑橘花药离体愈伤诱导难易程度。

外源激素是影响花药离体培养的关键因素。不同果树对不同植物生长调节剂种类、浓度的反应不同，需在试验中找到各自适合的组合配方。目前国内外有关柑橘花药离体愈伤诱导技术报道相对较少，可直接借鉴的培养基配方技术参数相关资料更少。利用正交设计试验研究柑橘花药愈伤诱导分化培养基激素组合，可快速有效地筛选、判断培养基添加适用外源激素种类及浓度范围。2，4-D，TDZ和BA 是植物组培中愈伤诱导的重要添加激素［8，13，15］，细胞分裂素/生长素比值及绝对浓度 控制接种外植体的脱分化及再分化形态建成的方向，直接影响花药外植体愈伤诱导结果。本研究通过正交试验结果分析发现，6-BA，TDZ，2，4-D 3种生长调节剂对供试柑橘花药离体愈伤诱导的影响主次顺序为2，4-D ＞TDZ ＞6-BA，(BA+TDZ)/2，4-D 比值在3～4∶1 范围内可较大程度地促进柑橘花药离体愈伤诱导。更易促进柑橘花药愈伤诱导的细胞分裂素/生长素比值是否也在该范围内，有待进一步试验。

柑橘花药接种前期在 (6 ±2)℃低温预培养5～10 d 有利于柑橘花药离体培养后的愈伤诱导。本试验结果与陈力耕等［7-8，12］适当时长的低温预处理促进花药愈伤诱导的研究结果一致。目前针对不同作物物种花药诱导培养各实验室所采用的低温预处理绝对温度不尽相同，宜根据不同低温试验获取各自的适宜处理时长。试验中还发现，不经低温预处理的对照组柠檬花药外植体诱导率仍可达48.1%，一定程度上说明低温预处理非花药愈伤诱导必不可少的决定性技术因子。低温预处理促成愈伤组织形成，可能与其在不影响花药内花粉正常生长前提下，延缓离体培养的花药熟化，为花药吸收外源激素尽快促成生殖生长向营养生长转变有关。

目前实验室已成功诱导获取北京柠檬、439 桔橙、四季桔等4个柑橘品种花药愈伤组织，并根据愈伤发生部位不同，分类继代增殖及保存，下阶段可进一步开展愈伤材料倍性检测、胚状体或再生芽诱导等试验研究。

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