蓝舌病病毒17型VP2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

王凌凤，杨 涛，孙恩成，耿宏伟，秦永丽，赵 晶，蔡绪禹，刘霓红，李文京，吴东来*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室，黑龙江 哈尔滨 150001；2.中国动物疫病预防控制中心，北京 100125)

蓝舌病(Bluetongue，BT)是一种由蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的通过库蠓等昆虫传播的非接触性病毒性动物传染病，以发热、白细胞减少、颊粘膜和胃肠道粘膜严重卡他性炎症为主要特征。主要感染反刍类动物，动物感染BTV的平均死亡率为30%，绵羊可高达80%[1]。BT广泛流行于热带、亚热带及温带国家，给家畜饲养业带来严重经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须呈报性疾病，我国将其列为一类动物疫病。

BTV基因组由10个双链RNA节段组成，包裹于双层衣壳内。内层衣壳由L3和S7基因编码的VP3和VP7组成，VP3和VP7为病毒的群特异性抗原；外层衣壳由L2和M5基因编码的VP2和VP5组成，VP2和VP5属于BTV的型特异性抗原[2]。其中，VP2存在许多能够诱导产生中和抗体的抗原表位[3]，对BTV的型特异性起决定作用，根据中和试验可以将BTV划分为24个血清型。本实验应用原核表达的两段重组BTV17 VP2蛋白制备了型特异性单克隆抗体(MAb)，并对其抗原表位进行了鉴定，为BTV17型特异性检测方法的建立和VP2蛋白功能的研究奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 原核表达载体pET-30a、E.coli DH5感受态细胞、E.coliBL21感受态细胞、SP2/0细胞、BHK-21细胞、pFast-VP2重组质粒、抗BTV17型绵羊阳性血清、BTV株(1、2、3、5、8、10、11、16、17、23、24 血清型)、茨城病病毒(IBAV)均由本研究室保存；MA-104细胞、牛轮状病毒(BRV)、牛呼肠孤病毒(RV)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所于力研究员提供；各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、反转录酶、TaqDNA聚合酶、DNA Marker均购于宝生物工程(大连)有限公司；蛋白Marker购自Fermentas公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG、异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗鼠IgG、HRP标记的驴抗绵羊IgG、抗猪IFN-MAb、邻苯二胺(OPD)均购自GIBCO公司；弗氏佐剂、50%PEG、50×HAT、50×HT和8-氮鸟嘌呤(8-AG)均购自SIGMA公司；IPTG购自Merck公司；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；质粒小量抽提试剂盒购自AXYGEN公司；胶回收小量试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司；SBA ClonotypingTMSystem/HRP抗体亚类鉴定试剂盒购于Southern Biotechnology公司；BALB/c雌鼠由中国农业科学院哈尔滨兽医所实验动物中心提供。

1.2 抗原的制备与纯化

1.2.1 VP2蛋白在大肠杆菌中的原核分段表达 根据GenBank中登录的BTV17的L2基因序列(M17438.1)设计两对引物，VP2-523：5'-GGTGG ATCCATGGAGTTGTTCCACGCGTTG-3'(BamHⅠ)，VP2-1770：5'-GCGAAGCTTCAAATATTGAAAAACC GCGGA-3'(Hind Ⅲ)；VP2-1561：5'-CGGGTACCATG TTTAACGCGCGCTTAAGA-3'(Kpn Ⅰ )， VP2-2868：5'-CCGAAGCTTCTAGACATTCAATAGTTTCGT-3'(HindⅢ)。以pFast-VP2重组质粒为模板分别扩增BTV VP2 A和B片段。分别将A片段与原核表达载体pET-30a经BamHⅠ和HindⅢ双酶切，B片段与pET-30a经KpnⅠ和HindⅢ双酶切，胶回收连接转化DH5α，挑单菌落提取重组质粒，经酶切鉴定正确后由上海英骏公司测序。将测序正确的重组质粒pET-A和pET-B分别转化大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达，将表达产物进行SDS-PAGE分析和western blot鉴定(抗BTV17型绵羊血清50倍稀释作为一抗，HRP标记的驴抗绵羊IgG 5000倍稀释作为二抗，具体步骤参考文献[4])。

1.2.2 重组蛋白纯化 以SDS-PAGE分析重组蛋白的表达，用Ni-NTA His-Band树脂纯化重组蛋白。

1.3 动物免疫 以纯化的重组蛋白VP2-A和VP2-B共同免疫6周龄BALB/c雌鼠，间隔两周免疫一次。首免每只鼠用75 g VP2-A和75 g VP2-B加弗氏完全佐剂腹腔注射，二免和三免用100 g VP2-A和100 g VP2-B加弗氏不完全佐剂腹腔注射，三免后一周测血清抗体效价，达到要求后以二免相同的剂量不加佐剂进行加强免疫，3 d后取其脾细胞进行细胞融合。

1.4 杂交瘤细胞株的建立 按文献[5]的方法操作。

1.5 MAb的鉴定

1.5.1 MAbs的腹水制备 选取8周龄～10周龄的BABL/c雌鼠，腹腔注射0.5 mL灭菌液体石蜡，7 d后注射杂交瘤细胞，1×106～2×106个细胞/只，约7 d后收集腹水。

1.5.2 细胞培养上清及腹水中MAb效价的测定将杂交瘤细胞上清及MAb腹水进行梯度稀释，通过间接ELISA方法测定其效价。

1.5.3 MAb免疫球蛋白亚类鉴定 利用SBA ClonotypingTMSystem/HRP抗体亚类鉴定试剂盒对MAb进行亚类鉴定。

1.5.4 杂交瘤细胞的染色体计数 按文献[6]的方法操作。

1.5.5 MAb的western blot鉴定 将重组蛋白VP2-A和VP2-B经SDS-PAGE转印硝酸纤维素膜，分别用杂交瘤细胞上清作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗，进行western blot分析。

1.5.6 MAb的特异性鉴定 将 BTV1、BTV2、BTV3、BTV5、BTV8、BTV10、BTV11、BTV13、BTV16、BTV17、BTV23、BTV24、IBAV 接 种 于BHK-21细胞，BRV、RV接种于MA-104细胞。培养48 h后用预冷的75%乙醇固定30 min，以MAbs腹水(10倍稀释)为一抗，同时设立未接病毒细胞对照及阴性和阳性血清(200倍稀释)对照，FITC标记羊抗鼠IgG(50倍稀释)为二抗，荧光显微镜下观察结果。

1.5.7 杂交瘤细胞的稳定性检测 将冻存的杂交瘤细胞复苏并多次传代，检测培养上清中抗体效价，分析杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性。

1.6 抗原表位的鉴定 根据筛选的MAb与两个重组蛋白的反应情况，对MAb所识别的抗原表位进行初步定位，根据重组蛋白VP2-A和VP2-B重叠区域的氨基酸序列(515aa～596aa)合成8条重叠短肽，W1：KWISSPMFNARLRITK；W2：RLRITKGEIGTS KKDD；W3：TSKKDDPWNNRAVRGY；W4：RAV RGYIKSPAESLDF； W5： AESLDFVLGPYYDLRL；W6：YYDLRLLFFGETLSLK；W7：ETLSLKQEQSA VFQYL；W8：AVFQYLSQLDDF。8条短肽分别以100 ng/孔包被ELISA板，MAb腹水100倍稀释作为一抗，同时以抗猪IFN-MAb作为对照，通过间接ELISA方法进行鉴定。根据检测结果，进一步合成10条短肽(表1)，按上述的间接ELISA方法对MAb所识别VP2蛋白抗原表位进行精确定位。短肽均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 针对VP2抗原表位合成的短肽Table 1 Synthesized peptides for VP2 epitopes identification

1.7 抗原表位的保守性分析 利用European Bioinformatics Institute(EBI)数据库提供的氨基酸序列Blast程序，对鉴定出的VP2蛋白抗原表位进行保守性分析。

2 结果

2.1 VP2蛋白在大肠杆菌中的分段表达 重组表达质粒pET-A经BamHⅠ和HindⅢ双酶切，得到约5400 bp和1250 bp的两个片段，pET-B经KpnⅠ和HindⅢ双酶切，得到约5400 bp和1300 bp的两个片段(图略)，与预期相符。测序结果正确。

SDS-PAGE结果显示，含有pET-A和pET-B的重组菌分别在28℃诱导8 h后均在约50 ku处出现一条蛋白带，与预期相符，而未诱导的重组菌及空载体重组菌诱导产物在相应位置无蛋白条带(图1)。Western blot结果表明，两个重组蛋白在50 ku处均有特异条带，而空载体重组菌表达对照无此条带(图1)；表明重组蛋白VP2-A和VP2-B均可以被抗BTV17阳性血清识别。重组蛋白主要以包涵体形式存在，用8 M尿素溶解后按照说明书进行变性纯化。

图1 重组蛋白的SDS-PAGE分析及western blot检测结果Fig.1 SDS-PAGE and western blot analysis of expressed recombinant proteins

2.2 杂交瘤细胞株的建立 免疫的BALB/c鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后，经间接ELISA筛选及3次细胞克隆纯化后，得到2株分泌抗BTV17 VP2蛋白MAb的杂交瘤细胞，分别命名为3F4和4H10。

2.3 MAb的鉴定

2.3.1 MAb效价及MAb免疫球蛋白亚类的测定经间接ELISA测定MAb 3F4和4H10杂交瘤细胞上清的效价均为 1∶103，腹水效价均为 1∶105；2 株MAbs亚类均为IgG1/κ链。

2.3.2 杂交瘤细胞的染色体计数 MAb 3F4和4H10杂交瘤细胞的染色体数分别为99条和100条，具有杂交瘤细胞染色体特征。

2.3.3 MAb的western blot鉴定 分别用2株MAb检测原核表达产物，同时设置空载体重组菌表达对照。Western blot检测结果表明，2株MAb均与重组蛋白VP2-A和VP2-B特异性结合，与空载体重组菌对照无反应。

图2 2株MAb的western blot鉴定结果Fig.2 Western blot identification of MAb reacted with VP2 expressed inE.coli

2.3.4 MAb的特异性鉴定 分别用2株MAbs检测接种 BTV1、BTV2、BTV3、BTV5、BTV8、BTV10、BTV11、BTV13、BTV16、BTV17、BTV23、BTV24、IBAV的BHK-21细胞及接种BRV、RV的MA-104细胞。结果表明，4H10仅与BTV17呈阳性反应(图3，表2)；而3F4与BTV17呈阳性反应，与BTV10和BTV24呈弱阳性反应，与其他病毒均呈阴性反应(表 2)。

图3 MAbs与BTV17的IFA鉴定Fig.3 IFA assay of MAbs reacted to BTV17 infected cells

表2 IFA鉴定MAbs的特异性结果Table 2 IFA assay of MAbs to different serotypes of BTV and IBAV,BRV,RV

2.3.5 杂交瘤细胞的稳定性检测 将冻存3个月的杂交瘤细胞复苏后，检测培养上清中效价为1∶103～1∶104，将杂交瘤细胞经多次连续传代，仍能稳定分泌特异性MAb。

2.4 抗原表位的鉴定

2.4.1 抗原表位的初步筛选及精确定位 Western blot结果表明，MAb 3F4和4H10与重组蛋白VP2-A和VP2-B均呈特异性反应，表明2株MAb针对的抗原表位位于两个蛋白的重叠区，针对重叠区的氨基酸序列合成多肽对2株MAb进行抗原表位的鉴定。8条短肽W1～W8与2株MAb的间接ELISA检测结果表明，2株MAb均只与W3呈阳性反应，抗原表位初步定位在16个氨基酸区段内。将W3前后逐级缺失5个氨基酸，合成10条短肽W9～W18包被ELISA板，间接ELISA检测结果表明，MAb 3F4与10条短肽均呈阳性反应，表明W3前后5个氨基酸不是MAb 3F4所识别表位的关键氨基酸，从而将MAb 3F4所识别的表位精确定位为540DPWNNR545。MAb 4H10与W18呈阴性反应，与其他9条短肽均呈阳性反应，表明第546位的A是MAb 4H10所识别表位的一个关键氨基酸，从而将MAb 4H10所识别的表位精确定位为540DPWNNRA546(图4)。

图4 合成短肽的间接ELISA分析Fig.4 Analysis of synthetic short peptides by indirect ELISA

2.4.2 抗原表位的保守性分析 BLAST结果显示所鉴定的两个BTV17 VP2蛋白的抗原表位在同型病毒株中相对保守。与3F4呈弱阳性反应的BTV10中VP2的相应区段(540DPWSNR545)只有一个氨基酸的差异；而与BTV24 VP2的相应区段(539DPWNNR544)一致，但出现一个氨基酸的移位；与其它型病毒株VP2的相应区段具有显著差异。

3 讨论

BTV血清型众多[7-8]，而且不同血清型之间无交互免疫性，因此预防该病的关键是建立快速的血清型鉴定方法对流行的BTV不同血清型做出鉴定，并采用相应血清型的疫苗，才能有效控制该病。国内应用的检测方法主要是琼脂糖免疫扩散试验，间接ELISA和斑点ELISA，但这些方法特异性不高[5]。竞争ELISA方法是国际公认的灵敏性高、特异性好的检测方法。目前，我国仅有关于BTV群特异性MAb制备的报道[3,5]，尚无以MAb建立的病毒血清型检测方法。本研究应用重组表达的BTV17 VP2蛋白制备了2株BTV17型特异性MAbs，为BTV17型特异性检测方法的建立提供了诊断试剂。

本研究曾尝试采用纯化的BTV及bac-to-bac昆虫杆状病毒表达系统表达的重组VP2蛋白作免疫原。由于BTV纯化效果不理想，达不到免疫需要的纯度和浓度，而且纯化过程繁琐，产量低，成本高；此外采用病毒免疫具有一定的生物安全隐患[9]。而真核表达的重组VP2蛋白量少且纯化效果不好。原核表达系统具有高效表达的特点，并且可以通过标签蛋白制备获得高纯度的重组蛋白，有利于MAb的制备。BTV17 L2基因编码区为2868 bp，由于长片段基因在原核表达系统中难以表达，因此本研究采用分两段的方法进行表达。并采用IFA试验对MAb特异性做进一步鉴定，以排除假阳性克隆[10]。

本研究以合成短肽的方法鉴定出BTV17 VP2蛋白的两个线性抗原表位：540DPWNNR545及540DPWNNRA546。所鉴定表位与BTV10和BTV20的VP2相应区段具有保守性。国外也曾报道过BTV10与BTV17存在共同的中和性抗原表位[11]，这可能与编码BTV10和BTV17 VP2的L2基因间具有较高的同源性有关。通过表位序列的分析表明BTV24的VP2与MAb 3F4识别的线性抗原表位有一个氨基酸移位，使BTV24与MAb 3F4出现弱阳性反应。本研究抗BTV17 VP2型特异性MAb的制备及其抗原表位的鉴定，为BTV17型特异性检测方法建立和BTV17 VP2功能分析奠定了基础，对BT的监控及防制具有重要意义。

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