四环素外排泵耐药基因tet40和tet42的研究进展

王秋霞，田 凯，李 杰，赵敬翠，刘明春

(沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁 沈阳 110866)

四环素类药物是发现于上个世纪40年代的一类广谱抗生素，从50年代开始应用于医学临床[1]。由于其具有抗菌谱广和毒性低等特点，因而在兽医临床上得到广泛应用，成为用于防治细菌性感染的常见药物。随着药物使用年限的增加，四环素类药物的耐药水平和耐药率也随之增强。有研究显示，分离自猪、牛、人的大肠杆菌O157对四环素的耐药率极高(97%，100%，100%)[2]，在184株沙门菌分离株中，四环素的耐药率达到了66%[3]。

迄今为止，已发现了40多种不同类型的四环素耐药基因，主要介导3种不同的耐药机制，分别为核糖体保护机制(Target protection)、外排泵机制(Active efflux)和酶降解机制(Enzymatic degradation)[4]。其中，外排泵机制对细菌耐药性的产生发挥着重要的作用。因此，研究四环素外排泵耐药基因的结构和特点，对治疗耐药细菌的感染、控制耐药细菌的出现和耐药性的传播等方面都具有极其重要的意义。

1 已发现的四环素外排泵耐药基因

四环素的外排泵耐药基因通过编码膜相关蛋白使细菌细胞内四环素主动泵出胞外，从而起到降低细胞内药物浓度及保护细菌的作用，同时使细菌产生耐药性。自从四环素外排泵基因tetA在大肠杆菌中发现以来，目前已经有20多种四环素外排泵基因在革兰氏阳性菌和阴性菌中相继被发现[5]。其中包括，发现较早的tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tetZ、tetI、tetJ、tet30、tetL、tetK、otrB、tcr3、tetA(P)；以及分支杆属(Mycobacterium)的 tetV[6]、链霉菌属(Streptomyces)的 otrC[5]、棒状杆菌属(Corynebacterium)的 tet33[7]、水生细菌哈氏弧菌(Vibrio harveyi)的tet35[8]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的 tet38[9]、不动杆菌属(Acinetobacter)的 tet39[10]。这些基因大多数存在于可移动基因元件中(如：质粒、转座子、插入序列元件和整合子)，并常与其他耐药基因相连，使细菌表现出多重耐药性。

2 新发现的四环素外排泵耐药基因

2.1 与其他基因串联的四环素外排泵耐药基因tet40的发现 Scott等从分离自一位曾长期接受四环素治疗的健康志愿者粪便样品的化糖梭状芽胞杆菌K10(Clostridium saccharolyticumK10)中发现了一种新的四环素耐药基因tet40(AJ295238)。tet40编码一种膜结合蛋白，与TetA(P)氨基酸的同源性为42%。在表达该蛋白的大肠杆菌中，四环素不能积聚；而且当携带tet40的大肠杆菌在含有外排泵抑制剂的培养液中培养时，细菌对四环素的耐药性也会随之降低。因此，推测tet40编码外排泵蛋白，发挥外排泵耐药机制。tet40的基本信息见表1。

表1 新发现的四环素外排泵耐药基因的基本信息Table 1 foundational information of novel tetracycline efflux genes

2.1.1 tet40耐药基因及其编码蛋白

在四环素耐药的化糖梭状芽胞杆菌K10中，发现了3种四环素耐药基因，其中两种是介导核糖体保护蛋白耐药的tetW和同源嵌合体tet(O/32/O)，另一种是新发现的介导外排泵耐药的tet40[12]。tet40位于tet(O/32/O)终止密码子下游区50个核苷酸处，与tet(O/32/O)这样的嵌合体不同，拥有独自的核糖体结合位点(Ribosome binding site，AGGAG)和标准的Pribnow-Gilbert box(-10TATAA和-35TTAACA)。tet40的G/C含量为56.5%，而tet(O/32/O)编码区的G/C含量为41%，这表明tet(O/32/O)和tet40应该源于不同的供体微生物。

tet40编码的蛋白质与产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的四环素外排泵蛋白TetA(P)、TetA408(P)的氨基酸序列同源性分别为42%和43%[13-14]。分析发现，Tet40和 TetA(P)、TetA408(P)的外排蛋白基序 E60x P62xxxxxD68xxxR72R73非常保守，而且它们的共有基序ExPxxxxxDxxxRK也非常相似。Tet40的氨基酸残基与TetA(P)主要的功能区氨基酸序列 62、63、119、122、137、233、236和361位的脯氨酸、苏氨酸、两个丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和丝氨酸高度保守。Tet40上分别位于53、60和90的3个推测的谷氨酸残基与TetA(P)的3个重要的谷氨酸残基也是高度同源的[12]。同时，Tet40还同TetA(P)一样有12个跨膜区。Tet40与TetA(P)的氨基酸序列同源性达42%。根据氨基酸同源性划分四环素外排蛋白的方法，TetA(P)和Tet40同属于第四类外排泵蛋白，在革兰氏阳性梭菌属中较为常见[15]。

2.1.2 tet40的分布和特点 2008年之前的研究普遍认为化糖梭状芽胞杆菌K10携带两个核糖体保护类型的耐药基因，tetW和嵌合体tet(O/32/O)[16-17]。直到最近，才发现了与tet(O/32/O)串联存在的另一个四环素耐药基因tet40。许多相同或不同机制的四环素耐药基因都可以在同一活动基因元件上存在，如tetM和tetL[18]，tetA408(P)和tetM[14]，tetA(P)和tetB(P)[13]，这可能是导致耐药基因广泛存在、耐药性迅速增强的原因之一。上述现象与tet(O/32/O)嵌合体一样，都是在药物强大选择压力作用下的产物。而与tet(O/32/O)不同的是，在化糖梭状芽胞杆菌K10中tet(O/32/O)和tet40相互不重叠，有不同的核糖体结合位点，但能共同通过相同的转运因子转移。

tet40具有自己的核糖体结合位点和Pribnow-Gilbert box。对tet40的单独研究发现，在没有与tet(O/32/O)串联的情况下，四环素对携带tet40基因的大肠杆菌的半数抑制浓度(IC50)为60 μg/mL，远高于未转入tet40前的2 μg/mL。这表明在实验室条件下，tet40可以单独存在，并介导对四环素的耐药。

串联存在的核糖体保护蛋白基因和外排泵基因可介导宿主细胞更高水平的四环素耐药性。tet(O/32/O)是猪和人粪便样品中检出率较高的四环素耐药基因之一[17]。tet40可能像tet(O/32/O)一样是一种在肠道菌群中大量存在的四环素耐药基因。tet40在化糖梭状芽胞杆菌K10的检出表明，外排泵基因不仅介导革兰氏阴性菌的耐药[5]，也可介导革兰氏阳性菌对四环素的耐药。

2.2 古细菌中的四环素外排泵耐药基因tet42的发现Brown等在美国华盛顿州的Energy Hanford Site(HS)距地表170 m～210 m深处提取到一些沉积物的细菌中发现了一种新的四环素耐药基因，tet42(EU523697)[19]。Tet42蛋白质具有外排蛋白的特征，与TetA(Z)有30%氨基酸序列同源性，因此推测其编码外排泵蛋白，发挥外排泵耐药机制。tet42的基本信息见表1。

2.2.1 tet42耐药基因及其编码蛋白 Tet42包括一个TetR转录抑制物、一个保守的GxxSDRxGRR基序和跨膜区。tet42含有两个不同的可转录的开放阅读框架(ORFs)。短一些的ORF(612核苷酸)与tetA的抑制物tetR相似；另一个ORF(1287核苷酸)与已知的四环素外排泵基因序列的同源性较低。

长一些的ORF编码一个429个氨基酸的序列，与TetA(Z)的同源性为30%[20]，与已知四环素耐药决定子的同源性小于80%，因此根据当前的命名规则[21]将其命名为TetA(42)。TetA(42)可能有十个跨膜区，分别位于aa 19 ～aa 41、aa 51～aa 73、aa 85～aa 107、aa 112～aa 131、aa 143～aa 165、aa 169～aa 191、aa 228～aa 250、aa 260～aa 282、aa 291～aa 313和aa 378～aa 400。这与已知的外排泵蛋白含有12或14个跨膜区的特点大不相同[22]。TetA(42)还包含一个所有四环素外排泵序列都普遍存在的 GxxSDRxGRR基序[23]，TetA(42)中的该区域(GrlSDRfGRR)与TetA(Z)的相同。短一些的ORF命名为TetR(42)，含204个氨基酸，与Streptomyces ambofaciens的TetR转录调节子有41%氨基酸同源性[24]，可能是四环素耐药的调节蛋白质。

tetA(42)和tetR(42)是反向的。这两个ORFs之间存在一个71 bp的基因间区域，包含tetA(42)和tetR(42)各自的TetR结合操纵基因和启动子[22-23]。tetR(42)操纵基因(CGACAGTCTATCG)和 tetA(42)操纵基因(GACTACACT TTCG)不是理想的回文序列，其中有7个碱基不同。两个操纵基因的前半段序列不太相似，但后半段序列除了一个碱基外都相同。

2.2.2 tet42的分布和特点 携带tet42的细菌分离自地下深处距今300万年的沉积物中[25]，它们没有接触过化学合成的抗生素，更没有接触过大量、长期抗生素选择压力下演化而来的耐药基因。但这些菌株却对包括四环素在内的几种抗生素表现出一定的耐药性。含有tet42的耐药转化株与不含tet42的野生型菌株对四环素的敏感性不同，最小抑菌浓度(MIC)从4 μg/mL增加到32 μg/mL。而且分离自沉积物中的7个菌株都检测到了tet(42)基因。研究表明，HS的沉淀物中发生了水平基因传递(HGT)；存在于没有抗生素的环境中的菌株同样具有抗生素耐药性，菌体内的外排泵蛋白可能与其清除重金属或其他毒素的功能有关[26-27]。

这一远离地面影响的新基因的发现为细菌耐药性的出现和耐药基因的演化提供了实际依据，也为存在于环境中但尚未检测到的非特异性的耐药机制的发现提供了可行性依据。

3 展望

四环素耐药基因广泛存在于人、动物和环境的细菌中[3,28]，对人类健康、用药安全和环境卫生等构成了严重的威胁和危害。在药物选择压力下，细菌耐药性的出现及传播问题已经成为药理学研究的热点议题。研究耐药基因和耐药机制，将为更好的应对菌株耐药性的产生及寻求科学合理的解决方案发挥着积极、重要的作用。

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