H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

崔佳莹，李 印，于 扬，张文亮，邓国华，陈化兰

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150001)

禽流感(Avian influenza，AI)是由A型禽流感病毒(AIV)引起的一种禽类的感染和(或)疾病综合征，根据AIV致病力分为非致病性禽流感病毒(NPAIV)，低致病性禽流感病毒(LPAIV)和高致病性禽流感病毒(HPAIV)3种[1]。H5N1亚型病毒株属于HPAIV，其对养禽业的危害使得该亚型AIV的快速诊断成为研究热点[2-4]。

血凝素(Hemagglutinin，HA)为AIV的表面糖蛋白(75 ku)，是构成AIV囊膜纤突的主要成分之一，直接参与了AIV的致病过程[5]，编码HA的基因发生点突变引起抗原漂移是病毒HA发生抗原变异的主要原因之一[6]。本实验以AIV H5N1GD261作为免疫原，应用淋巴细胞杂交瘤技术制备了针对其HA蛋白的单克隆抗体(MAb)，对快速检测具有该抗原类型的AIV有着重要的应用价值[7]。

1 材料和方法

1.1 实验材料 AIV H5N1GD261分离株、骨髓瘤SP2/0细胞由本实验室保存；4周龄～6周龄及6周龄～10周龄清洁级BALB/c雌鼠购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT选择培养基、HT培养基和PEG(MW1500)融合试剂、秋水仙素、灭活剂β-丙内酯、筛选剂8-AG均购自Sigma公司；胎牛血清、DMEM培养基购自Invitrogen公司；鼠源MAb亚类鉴定试剂盒、HRP和FITC标记羊抗鼠IgG购自Southern Biotech公司；底物OPD购自Seebio Biote-chnology公司。

1.2 MAb的制备与鉴定

1.2.1 动物免疫及MAb的制备 以H5N1GD261为免疫原，将病毒浓缩灭活后与弗氏完全佐剂等体积乳化，免疫6周龄～8周龄BALB/c小鼠，在首免后第15 d和30 d用弗氏不完全佐剂乳化的病毒加强免疫，细胞融合前3 d腹腔注射加强免疫。无菌取免疫小鼠脾脏，常规方法细胞融合，在融合后第3 d和第7 d分别对融合细胞进行半量换液。

1.2.2 MAb检测方法的建立 融合后第10 d，以4 u的病毒作检测抗原包被ELISA板，取融合细胞上清液进行检测，并以SP2/0培养上清和免疫小鼠阳性血清分别做阴阳性对照，初步建立筛选MAb的间接ELISA方法。判定标准为阳性血清的OD490nm值1.0左右，P/N最大。

1.2.3 制备腹水 按照常规方法制备腹水。

1.3 MAb的鉴定

1.3.1 杂交瘤细胞染色体鉴定 采用秋水仙素法对杂交瘤细胞进行染色体鉴定。

1.3.2 MAb亚类鉴定 按照Sigma公司鼠源MAb亚类鉴定试剂盒说明书进行。

1.3.3 杂交瘤细胞的稳定性检测 对冻存的杂交瘤细胞株分别在第3月，第6月复苏，连续传4代并且收集上清液，用间接ELISA检测培养上清中的抗体效价。用HI方法对杂交瘤细胞株进行抗体分泌能力的测定。

1.3.4 抗体效价测定 以HI实验测定培养上清和腹水的抗体效价。

1.3.5 广谱性检测 将细胞培养上清分别与H5不同病毒株进行HI试验，检测MAb的广谱性。

1.3.6 HA亚型及病毒特异性检测 取培养上清分别与AIV H1～H15亚型标准毒株和新城疫病毒(NDV)进行HI试验。

1.3.7 间接免疫荧光试验(IFA) 将1∶100稀释的免疫原病毒H5N1GD261接种MDCK细胞，37℃培养48 h后冷甲醇固定细胞，以杂交瘤细胞培养上清液作为一抗，以FITC标记羊抗鼠IgG作为二抗，同时设立未感染病毒的MDCK作为阴性对照，荧光显微镜下观察结果。

2 结果与讨论

2.1 MAb的制备 阳性杂交瘤细胞经过4次克隆纯化及ELISA和HI筛选得到3株MAb，分别命名为1A4，2F5和3D3。

2.2 MAb细胞株染色体鉴定 各MAb细胞株染色体数分别为101、108和110，该数值接近脾细胞与骨髓瘤细胞的染色体数目之和，表明3株杂交瘤细胞为脾细胞与骨髓瘤细胞融合细胞。

2.3 MAb抗体亚类的鉴定 鉴定结果表明2F5为IgM类，其余2株均为IgG2a亚类，轻链均为κ链。

2.4 血凝抑制价结果 3株MAb腹水血凝抑制价分别为212、212和211，培养上清液的血凝抑制价分别为 29、28和 29。

2.5 广谱性检测 将细胞培养上清液分别与近2年流行病学调查所采集的12株H5亚型AIV进行HI试验，结果表明所制备的MAb能够与大部分的病毒株产生良好反应，具有与H5亚型较好的广谱性(表 1)。

表1 MAb的广谱性检测结果Table 1 Broad spectrum of MAbs by HI test

2.6 HA亚型及病毒特异性检测 用研制的MAb与15株亚型AIV及NDV病毒进行HI检测，结果表明所制备MAb与AIV其他亚型及NDV无交叉反应，表现出良好的特异性。

2.7 稳定性试验 3株杂交瘤细胞株分别在冻存后的第3个月、第6个月复苏培养，经过连续多次传代后检测细胞株分泌抗体的能力，用HI方法检测培养液上清，HI血凝抑制价分别由29、211和211下降为26、27和27。结果表明，杂交瘤细胞株分泌抗体的能力有所下降，但并未消失，稳定性良好。

2.8 IFA结果 所获3株MAb均与感染了相应H5亚型AIV的MDCK发生特异性结合，荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光，未感染病毒的MDCK细胞未见绿色荧光(图1)。

图1 MAb与感染H5亚型AIV MDCK的IFA试验结果Fig.1 Identification of the MAb against H5 subtype AIV in MDCK by IFA

MAb以其特异性高、敏感性强被广泛用于各类疾病病原的血清学检测和诊断中，使用针对H5亚型HA蛋白的MAb进行HI试验，可以大大提高检测的特异性和敏感性；同时用一系列的MAb可以对研究病毒的抗原性进行分析和归类，为研究病毒抗原性变异规律和研究病毒HA结构与功能提供物质条件。本实验制备的MAb通过与近年分离的AIV H5亚型病毒株进行HI试验分析，结果表明绝大部分新近分离株与这些MAb具有良好反应，而与以往经典病毒流行株标准血清反应性相对较差，表现出病毒一定的差异性。这些MAb的制备为开展H5亚型AIV抗原性差异研究、病毒抗原结构分析和完善病原学诊断研究等方面提供重要的物质条件。

[1]葛叶，邓国华，李雪平，等.流感病毒聚合酶PB1-1蛋白的表达与单克隆抗体的制备[J].中国预防兽医学报，2009，9(31)：726-729.

[2]Reperant L A,Rimmelzwaan G F,Kuiken T.Avian influenza viruses in mammals[J].Rev Sci Tech,2009.28(1):137-159.

[3]于康震，陈化兰，唐秀英.97香港禽流感[J].中国畜禽传染病.1998，20(3)：187-191.

[4]Abraham A,Sivanandan V,Karunakaran D,et al.Comparative serological evaluation of avian influenza vaccine in Turkeys[J].Avian Dis,1988,32(4):659-662.

[5]邵红霞，秦爱建，钱琨，等.抗禽流感病毒H5亚型血凝素特异性单克隆抗体的研制[J].中国动物检疫，2002，19(8)：21-23.

[6]Gao Yu-mei,Zhang Ying，Shinya K,et al,Identification of amino acids in HA and PB2 critical for the transmission of H5N1 avian influenza viruses in a mammalian host[J].PLoS Pathog,2009,5(12):1000709.

[7]Nakagawa N,Maeda A,Kase T,et al.Rapid detection and identification of two lineages of influenza B strains with monoclonal antibody[J].J Virol Methods,1999,79:113-120.