稳定表达T7 RNA聚合酶PK-15细胞系的建立

黄俊华，贺 番，孙 元，张 鑫，常天明，李宏宇，仇华吉

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室，黑龙江 哈尔滨 150001)

T7 RNA聚合酶(RNAP)是T7噬菌体编码的一种依赖于DNA的RNAP，对T7启动子序列具有高度特异性，是分子克隆和反向遗传操作常用的RNAP。T7 RNAP基因能够稳定地整合到哺乳动物细胞的基因组中，并且可以在多种靶细胞内高水平表达[1]。由于T7 RNAP在真核细胞中具有转录活性，广泛应用于病毒拯救[2]。PK-15细胞系是猪瘟病毒(CSFV)等猪源病毒的敏感细胞系，常用于CSFV的分离培养和体外增殖。本研究构建稳定表达T7 RNAP的PK-15细胞系，为CSFV等猪源RNA病毒的反向遗传操作提供有效的方法。

1 材料和方法

1.1 菌株、质粒和细胞 E.coliBL21(DE3)和DH5α均购自Solarbio公司；质粒pLXSN、pET-32a(+)、pDsRed1-N1、PT67细胞和PK-15细胞均由本实验室保存。

1.2 主要试剂 细菌基因组提取试剂盒购自天根公司；pMD18-T、逆转录病毒载体pLXSN、pDsRed1-N1、Platinum®Taq高保真DNA聚合酶和LipfectamineTM2000转染试剂购自Invitrogen公司；质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒和组织DNA提取试剂盒均购自Omega公司；NdeⅠ、BsrGⅠ、ScaⅠ、XhoⅠ、KpnⅠ、BamHⅠ、SmaⅠ和T4 DNA连接酶均购自NEB公司；抗T7 RNAP单克隆抗体(MAb)购自Novagen公司；新霉素(G418)和FITC标记的羊抗鼠IgG均购自Sigma公司。

1.3 T7 RNAP基因的扩增与克隆 按照试剂盒说明书方法提取BL21(DE3)细菌基因组DNA，根据GenBank登录的T7 RNAP基因(M38308)序列，设计一对引物，PT7RNAP-F：5'-GAGCTCGAGCCACCAT GAACACGATTAACATCG-3'；PT7RNAP-R：5'-GAT GGATCCCGTTACGCGAACGCGAAGTCC-3'， (下 划线分别为XhoⅠ、BamHⅠ酶切位点，GCCACC ATGG是为提高在真核细胞中表达的Kozak序列[3])。PCR反应程序为：95℃ 5 min；94℃ 30 s、61℃30 s、68℃ 2.5 min，30个循环；72℃ 10 min。扩增片段经胶回收与pMD18-T载体连接，重组质粒pTS-T7RNAP经NdeⅠ和BsrGⅠ酶切鉴定正确后由Invitrogen公司测序。

1.4 表达T7 RNAP的重组逆转录病毒的构建 以ScaⅠ、XhoⅠ和BamHⅠ依次单酶切pTS-T7RNAP，胶回收约2700 bp的片段，与经XhoⅠ和BamHⅠ酶切并回收的pLXSN载体在T4 DNA连接酶的作用下连接构建pLXSN-T7，SmaⅠ和KpnⅠ酶切鉴定。按LipfectamineTM2000说明书方法分别将pLXSN-T7和pLXSN转染PT67细胞，6 h后以含10%胎牛血清的DMEM培养。37℃CO2培养72 h，经消化加入最佳筛选浓度的G418(200 μg/mL)，14 d后扩大培养，收集上清，70℃保存，将转染pLXSN-T7和pLXSN所获重组病毒分别命名为rMLV-T7和wtMLV。

1.5 重组逆转录病毒感染PK-15细胞的筛选及鉴定 将rMLV-T7和wtMLV分别接种于PK-15细胞内，吸附4 h，加入含10%血清的DMEM培养液培养24 h，加入最佳筛选浓度的G418(600 μg/mL)，培养14 d，将接种rMLV-T7的PK-15细胞用有限稀释法进行单细胞克隆纯化3代，获得的细胞系命名为PK/T7。

以细胞基因组DNA为模板，引物PT7RNAP-F和FT7RNAP-R进行PCR扩增，检测细胞基因组中是否整合了T7 RNAP基因；另取部分细胞铺于96孔板，12 h后吸出孔中的培养液，加入3%多聚甲醛常温固定30 min，加入抗T7 RNAP MAb，37℃1 h，加入 FITC标记羊抗鼠 IgG，37℃ 45 min，PBS洗涤后置于荧光显微镜下观察。

1.6 PK/T7细胞系外源基因转录和表达的检测 将pDsRed1-N1以SacⅠ和NotⅠ双酶切，胶回收红色荧光基因片段与pET-32a(+)载体连接，获得重组质粒pET-RED，经PstⅠ和NcoⅠ酶切鉴定并纯化，经脂质体转染至细胞系PK/T7中，同时转染pDsRed1-N1作为阳性对照，转染pET-32a(+)作为阴性对照，24h后荧光显微镜下观察红色荧光蛋白是否表达。将PK/T7细胞系每隔48 h传代一次，分别取第5代、第10代、第15代和第20代细胞冻存，复苏连续传3代后，用间接免疫荧光试验(IFA)和瞬时表达pET-RED检测该细胞系能否稳定表达有活性的T7 RNAP。

2 结 果

2.1 表达T7 RNAP的重组逆转录病毒的构建 以E.coliBL21(DE3)细菌基因组为模板PCR扩增编码T7 RNAP的基因，结果表明获得大小约为2700 kb的片段，与预期结果(2660 bp)相符；测序结果与GenBank登录的序列一致；T7 RNAP基因与pLXSN载体连接，获得重组质粒pLXSN-T7酶切鉴定正确；pLXSN-T7和pLXSN分别转染PT67细胞内，经G418筛选获得表达T7 RNAP的重组逆转录病毒rMLV-T7和野生型逆转录病毒wtMLV。

2.2 细胞系的筛选及鉴定 将rMLV-T7和wtMLV分别接种PK-15细胞，经筛选及有限稀释法，对感染rMLV-T7并经过G418筛选的PK-15细胞进行细胞克隆纯化，获得纯化细胞系PK/T7；PCR检测结果表明，PK/T7细胞样品扩增出T7 RNAP特异性条带，感染另外两种逆转录病毒的PK-15细胞均呈PCR阴性反应(图1)；生长于96孔板中的PK/T7细胞先后与一抗、二抗作用，荧光显微镜下观察均能观察到特异性绿色荧光，感染wtMLV的PK-15细胞和正常PK-15细胞均未产生绿色荧光(图2)。

2.3 细胞系转录活性的验证及稳定性检测 将pET-RED转染至PCR和IFA检测阳性的PK/T7细胞中，24 h后镜下观察，结果显示，阴阳性对照成立，并且转染pET-RED的孔中有特异性红色荧光，表明筛选所得的细胞系PK/T7中的RNAP具有转录活性。

为验证筛选的PK/T7细胞系的稳定性，采用IFA检测第5代、第10代、第15代和第20代细胞，结果表明各代次的PK/T7细胞均能表达T7 RNAP，而感染wtMLV的PK-15细胞和正常PK-15细胞则为阴性(图3)；转染pET-RED后48 h观察，结果显示这4个不同代次的PK/T7表达的T7 RNAP均具有转录活性，阴阳性对照均成立(图4)。

3 讨 论

目前，通常采用体外转录制备病毒基因组RNA的方式拯救猪源RNA病毒，但这种RNA转录子的感染性较弱而且会降低拯救病毒的效率[4-5]。而稳定表达T7 RNAP的细胞系能够实现细胞内转录，避免体外操作时RNA的降解，保证RNA转录本的正确性，使病毒拯救系统更加稳定、高效。研究表明，Buchholz等建立的表达T7 RNAP的BHK衍生细胞系(BSR T7/5)，已成功拯救出多种重组病毒[6-7]。Van等建立的稳定表达T7 RNAP的SK6细胞系(SK6.T7)具有能够有效克服病毒体外拯救效率低的缺点，提高CSFV在细胞水平拯救的效率[8]。

利用逆转录病毒载体插入外源蛋白编码序列，转染包装细胞系获得具有感染性的重组逆转录病毒，借此将目的基因整合进宿主细胞染色体内，经筛选可获得表达目的蛋白的细胞系。本研究构建了表达T7 RNAP重组逆转录病毒载体，转染PT67包装细胞系，经G418筛选获得较高滴度的重组逆转录病毒。接种PK-15细胞，经G418持续筛选及单细胞克隆纯化，应用PCR、IFA检测和转染瞬时表达T7启动子控制的红色荧光蛋白的重组质粒，建立了稳定表达具有转录活性的T7 RNAP的PK-15细胞系。该细胞系能够简化CSFV等病毒的拯救策略，实现病毒细胞内拯救，提高重组病毒的拯救效率。

[1]Elroy-Stein O,Moss B.Cytoplasmic expression system based on constitutive synthesis of bacteriophage T7 RNA polymerase in mammalian cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,1990,87(17):6743-6767.

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[3]Kozak M.At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells[J].J Mol Biol,1987,196(4):947-950.

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