汉防己甲素滴眼液抗兔眼滤过术区纤维化的疗效观察△

李 岱 李青春 孙 明 林少春 吴开力

青光眼滤过术区的纤维增生是导致手术失败的主要原因，目前临床上常用的丝裂霉素C(mitomycin C，MMC)等抗瘢痕化药物为非选择性抗代谢药物，易带来一些不可避免的滤过泡渗漏等并发症。汉防己甲素(tetrandrine，Tet)已广泛用于抗矽肺纤维化等全身疾病的治疗，且副作用少。我们前期报道了汉防己甲素可抑制体外培养的人眼Tenon囊成纤维细胞的增生［1］。本实验通过观察汉防己甲素滴眼液对抗兔眼滤过术区纤维化的作用，进一步探讨其作为青光眼滤过术后辅助用药的可能性及作用机制，旨在为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器 手术显微镜(SOM2000B，苏州)、Tono-Pen 眼压计(Model XL，mentor，Inc，美国)、裂隙灯显微镜(瑞士900型)、Olympus双筒显微镜(日本Olympus公司)、全自动图像分析系统(Kontron IBAS 2.0，德国)、彩色图像摄录输入仪(Axioplan2 imaging，德国)。

1.2 主要试剂 Tet滴眼液(天津第一中心医院药学部配制)、MMC、手术用平衡盐注射液(BSS)、复方妥布霉素等滴眼液及消毒液(中山眼科中心药剂室)。兔抗兔转化生长因子-β2(transforming growth factor β2，TGF-β2)多克隆抗体、即用型 SABC 试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3 实验动物及模型制作

1.3.1 实验动物及分组 纯种新西兰白兔20只40眼(中山大学北校区实验中心提供)，雌雄不拘，体质量为2.0～2.5 kg，兔龄4个月。实验前检查双眼眼前节、眼底及眼压均正常，排除眼部和全身疾病。所有动物随机分为4组，每组5只(10眼):A组:单纯手术组;B组:0.2 g·L－1MMC治疗组;C组:1 g·L－1Tet组;D组:赋形剂组。术前3 d用复方妥布霉素眼液滴眼，每天4次。术后观察时间内双眼滴药:A组滴生理盐水，C组滴1 g·L－1Tet，D组滴赋形剂，每天4次;B 组于术中应用0.2 g·L－1MMC。

1.3.2 模型制作 全部动物行标准统一的巩膜咬切术［2］，手术均由作者和一位熟练掌握巩膜咬切术的助手共同完成。全部兔用氯胺酮(50 mg·kg－1)和氯丙嗪(25 mg·kg－1)肌肉注射全身麻醉，测眼压后，升汞消毒液及无菌注射用水冲洗结膜囊，常规消毒术眼，置孔巾，开睑，上直肌缝线固定后，于眼球颞上方距角膜缘7.0 mm处平行角膜缘剪开球结膜、Tenon囊，分离至角巩膜缘，做一 7.0 mm ×10.0 mm以角膜缘为基底的结膜瓣，彻底止血。MMC组将浸泡过0.2 g·L－1MMC的棉片置于结膜瓣与巩膜床之间，结膜瓣覆盖并轻压5 min，然后去掉棉片，用50 mL生理盐水冲洗结膜瓣下组织及角膜。各组都在距角巩膜缘后界0.5 mm处全层切开巩膜，长3.0 mm，用巩膜咬切器咬除2.0 mm×3.0 mm后唇巩膜，做虹膜周边切除，10-0尼龙线连续缝合球结膜瓣。

1.4 观察内容和指标

1.4.1 并发症 术后1～7 d、14 d用裂隙灯观察结膜伤口、角膜、前房、虹膜、晶状体等情况。

1.4.2 滤过泡 术后1 d、3 d、7 d、14 d观察并记录滤过泡存留情况。根据滤过泡高度及其环绕角巩膜缘的范围用数值表示滤过泡的大小。滤过泡的高度分0～4分:0分表示滤过泡消失;1分为高于结膜平面肉眼可见的滤过泡;2分为较高的滤过泡，但高度低于角膜顶点平面;3分为与角膜顶点平面平齐的滤过泡;4分为高度高于角膜顶点平面的滤过泡。滤过泡的范围按滤过泡环绕角巩膜缘的钟点数记分，以0.5分作为增量，记分范围为0.5～12.0 分，滤过泡的实际分数等于滤过泡范围的分数加滤过泡高度的分数。每个滤过泡可得分的范围为 0.5～16.0分［3］。

1.4.3 眼压 用Tono-Pen眼压计测量并记录术后1 d、3 d、7 d、14 d 各组眼压。

1.4.4 免疫组织化学法观察汉防已甲素对组织切片中TGF-β2受体的影响 于术后7 d随机取A组和C组兔各1只，经耳缘静脉注入10 mL过滤空气处死，快速取出眼球，拆除球结膜缝线，取术区滤过口附近角巩膜缘组织4.0 mm×8.0 mm，然后经滤过道将眼球前后对半剖切，浸泡于体积分数10%福尔马林中固定，经滤过区矢状面取材做石蜡包埋切片(平行于手术切口子午线切片)，再按武汉博士德生物工程有限公司的即用型链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术(streptavidin-biotin peroxidose complex technique，SABC)免疫组织化学染色试剂盒和DAB显色试剂盒说明进行操作并加以改进:滴加兔抗兔TGF-β2多克隆抗体(体积比1∶100)于37℃下反应1 h，PBS洗3次，加相应二抗37℃反应40 min，PBS洗3次，加 SABC常温下20 min，PBS洗4次，加新鲜配制的DAB溶液，显微镜控制反应时间。蒸馏水冲洗，苏木素复染，常规封片。胞浆棕黄色为阳性。采用全自动图像分析系统对组织切片进行图像分析，所有组织切片均统一放大倍数(×200)，在同一强度下随机选取5个视野观察分析光密度值。

1.5 统计学方法 使用SPSS 11.0统计学软件进行分析，数据均以±s表示，均数间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 并发症 所有术眼术后均有不同程度前房Tyndall现象阳性反应，约3～5 d消失。未见其他并发症发生。

2.2 滤过泡的外观及评分 术后1 d，各组均可形成一个弥散隆起的滤过泡;术后3 d，各组滤过泡均已局限化，隆起度下降，但单纯手术组和赋形剂组下降度更明显，且其后迅速瘢痕化;术后7 d，单纯手术组和赋形剂组滤过泡非常局限，接近扁平，Tet组、MMC组滤过区苍白、较弥散、隆起;术后14 d，单纯手术组和赋形剂组滤过泡完全消失，而Tet组、MMC组滤过泡隆起但周围明显局限化(图1)。各组术后滤过泡评分见表1。术后1 d，各组滤过泡分值比较差异均无统计学意义(均为P＞0.05);术后3 d、7 d、14 d，单纯手术组和赋形剂组滤过泡分值相比差异无统计学意义(P＞0.05)，Tet组、MMC组分值均高于上述2组，差异均有显著统计学意义(均为P＜0.01)，而2组间比较差异无统计学意义(均为P＞0.05)。

Figure 1 At 14 days after filtration surgery.A:The appearance of filtering blebwas completely lost in surgery alone group;B:The appearance of filtering blebwas completely lost in vehiculumgroup;C:The appearance of filtering blebwas seen，but there was limitation around it in Tet group;D:The appearance of filtering blebwas seen，but there was limitation around it in MMC group 兔眼滤过术后14 d。A:单纯手术组，滤过泡完全消失;B:赋形剂组，滤过泡完全消失;C:Tet组，滤过泡隆起但周围明显局限化;D:MMC组，滤过泡隆起但周围明显局限化

2.3 各组眼压比较 单纯手术组和赋形剂组术后1 d、3 d眼压和术前相比差异均有统计学意义(均为P＜0.05);Tet组和MMC组术后各时间点眼压和术前相比差异均有显著统计学意义(P＜0.01)。各组间多重比较显示:术前和术后1 d各组间眼压比较差异无统计学意义(P＞0.05)。术后3 d、7 d、14 d，Tet组、MMC组分别与其他2组眼压比较，差异有显著统计学意义(均为P＜0.01);Tet组和MMC组、单纯手术组与赋形剂组组间眼压比较，差异均无统计学意义(均为P＞0.05，见表2)。

2.4 Tet对滤过区组织中TGF-β2表达的影响 显微镜下观察TGF-β2的表达阳性部位呈棕黄色，以胞浆为主(图2)。Tet组光密度值为0.440 ±0.045，明显低于单纯手术组的 0.655 ±0.049(P＜0.01)。说明Tet明显抑制TGF-β2的表达。

3 讨论

目前普遍认为青光眼滤过术后术区瘢痕形成的原因主要是手术引起组织创伤，导致多种细胞因子释放，刺激炎性反应和成纤维细胞的增殖和移行。成纤维细胞是功能活跃的纤维细胞，能合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白及蛋白多糖，组成新生胶原纤维、弹性纤维及网状纤维。由于大量纤维组织增生，致使滤过道瘢痕化和结膜下滤过泡空间被纤维组织填充，最终导致滤过手术失败［4］。而实验性滤过术抗瘢痕研究常以家兔为动物模型，因其伤口愈合反应比较活跃，与难治性青光眼术后反应相似［5］。既往的研究证实:在青光眼滤过术区伤口愈合过程的1～2周中，抑制成纤维细胞的增殖移行、新生血管形成和胶原的合成，是早期预防青光眼术后瘢痕形成的关键［6］。因此，本实验指标检测大都选定在这一时间范围。

Figure 2 Immunohistochemistry were carried out to examine the expression of TGF-β2protein in cells of surgical site，the brown positive was localized mostly in cytoplasm(×400).A:Tet group with less positive staining;B:Surgery alone group with more positive staining免疫组织化学检测滤过区中TGF-β2蛋白表达，阳性部位呈棕黄色，以胞浆为主(×400)。A:Tet组，表达弱阳性;B:单纯手术组，表达强阳性

形成具有良好性状和功能的滤过泡、眼压控制在理想范围内是抗青光眼滤过术成功的关键［3］，所以滤过泡的形态、大小和眼压的变化是相关研究的主要观察指标。本实验发现，术后局部滴用Tet 2周，其滤过泡的大体形态仍是隆起、弥散，与MMC组滤过泡基本相似;而单纯手术组和赋形剂组的滤过泡第1周就局限、接近扁平，2周后几乎消失，相对应的滤过泡分值明显低于Tet组。不同时期Tet组的眼压保持较低水平，与术前比较差异有显著统计学意义;单纯手术组和赋形剂组仅在术后1 d、3 d较术前眼压降低，且术后3 d、7 d、14 d与Tet组比较眼压升高，差异有显著统计学意义。由此可见，Tet可使滤过泡形成良好，并维持较长时间的低眼压。而瘢痕的形成与手术区成纤维细胞的增殖有关，术后滤过泡形成并维持，说明青光眼术后房水流出通畅，术区结膜下少有成纤维细胞增殖，未形成瘢痕，进而使眼压可控制在理想范围之内。同时也可进一步证实Tet抑制滤过术后瘢痕形成的功效。

Tet是中药来源的异哇琳类生物碱，既是天然的非选择性钙通道阻滞剂，又是钙调蛋白拮抗剂，药理活性广泛。既往的研究已证实Tet可抑制体外培养的兔结膜成纤维细胞及翼状胬肉和Tennon囊成纤维细胞的生长［7-8］。本实验首次采用Tet滴眼液在体证实其对抗滤过术区纤维化的作用。结合前期实验和以往的研究，我们分析和推测Tet的作用机制:(1)Tet使成纤维细胞钙离子内流减少，胞内钙离子浓度下降，依赖钙离子参与的DNA与蛋白合成受阻，细胞分裂、增殖受抑制和诱导其凋亡，进一步使胶原合成减少［9］;(2)抑制钙调蛋白的运动，使细胞骨架蛋白变构致细胞变圆，从而使胶原酶合成增加，胶原分解代谢增强［10］;(3)Tet通过影响细胞膜通透性而抑制肥大细胞组织胺的释放［11］，而组织胺具有增强胶原合成的作用，也是赖氨酰氧化酶的竞争性抑制剂，此酶受抑制可引起胶原异常联结［12］;(4)通过影响金属基质蛋白酶中其所含金属离子钙和锌含量，降低该酶的活性和稳定性，从而使胶原酶合成增加，加速细胞外基质的降解［13］;(5)通过创伤局部的成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞等的相互作用及其分泌和释放的细胞因子，如 PDGF、TGF-β、IL-1、TNF-α、IL-6、M-CSF、TGF-α、EGF、IGF-1、FGF-2 等，在多个环节上调节胶原的合成与分解，从而参与瘢痕形成的过程。其中在机体创伤修复过程中起最关键调控作用的细胞因子为 TGF-β，TGF-β不仅刺激细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)产生，而且抑制降解ECM的蛋白酶和基质酶的活性，从而促使ECM沉积。TGF-β对炎症细胞和成纤维细胞也具有强烈的趋化作用，吸引这些细胞到创伤局部，增强炎症反应;还可促进成纤维细胞增殖，刺激纤维蛋白原合成胶原和纤维连接蛋白，并促使它们在ECM上沉积。以上这些作用能增加创伤部位的细胞数和ECM合成，有利于促进伤口填充和愈合。但另一方面，TGF-β使ECM过度表达而不被降解，导致瘢痕形成，而与滤过手术联系最密切的则为TGF-β2［14］。本研究通过对Tet组和单纯手术组用免疫组织化学方法检测滤过区中TGF-β2蛋白的表达发现:Tet组表达弱阳性，而单纯手术组表达强阳性，2组光密度值比较差别有显著统计学意义，再次证实Tet对TGF-β2的拮抗作用。推测Tet抗纤维化作用与其拮抗TGF-β2的作用有关。抑制TGF-β2可抑制滤过区成纤维细胞的分化、增生，从而延长兔青光眼术后眼压下降的时间和有效滤过泡的生存时间［15］。

总之，前期研究和本实验都证实了汉防己甲素具有广谱的抗纤维化作用，对创伤愈合反应的多个环节均有抑制效能，Tet将为预防和治疗青光眼滤过性手术后滤过道的纤维瘢痕化提供新的途径，具有良好的应用前景，但其应用最佳浓度、安全剂量范围、给药周期、药物代谢动力学以及对眼组织的毒副作用等，还有待于进一步探讨。

1 李 岱，杨 柳，林少春，吴开力.汉防己甲素抑制人眼Tenon囊成纤维细胞的凋亡效应［J］.眼科研究，2010，28(1):1-4.

2 李 丹，刘 兵，林军军，茹海霞，张 梅.丝裂霉素C辅助青光眼滤过手术的实验研究［J］.眼科新进展，2003，23(3):179-181.

3 Theelen T，Wesseling P，Keunen JE，Klevering BJ.A pilot study on slit lamp-adapted optical coherence tomography imaging of trabeculectomy filtering blebs［J］.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，2007，245(6):877-882.

4 Haefliger IO，von Arx G，Pimentel AR.Pathophysiology of intraocular pressure increase and glaucoma prevalence in thyroid eye disease:a mini-review［J］.Klin Monbl Augenheilkd，2010，227(4):292-293.

5 How A，Chua JL，Charlton A，Su R，Lim M，Kumar RS，et al.Combined treatment with bevacizumab and 5-fluorouracil attenuates the postoperative scarring response after experimental glaucoma filtration surgery［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51(2):928-932.

6 Luke J，Luke M，Grisanti S.Antiangiogenic treatment for neovascular glaucoma and after filtering surgery［J］.Ophthalmologe，2009，106(5):407-412.

7 Kitano A，Yamanaka O，Ikeda K，Ishida-Nishikawa I，Okada Y，Shirai K，et al.Tetrandrine suppresses activation of human subconjunctival fibroblastsin vitro［J］.Curr Eye Res，2008，33(7):559-565.

8 杨 柳，李 岱，吴开力.汉防己甲素对体外人眼Tenon囊成纤维细胞的抑制效应［J］.国际眼科杂志，2009，9(4):653-655.

9 Chen J，Liu J，Wang T，Xiao H，Yin C，Yang J，et al.The relaxation mechanisms of tetrandrine on the rabbit corpus cavernosum tissuein vitro［J］.Nat Prod Res，2009，23(2):112-121.

10田 峰，田立杰，季相禄.抑制胶原纤维合成延缓失神经支配骨骼肌萎缩的实验研究［J］.中国修复重建外科杂志，2007，21(6):561-564.

11孟德胜，宋裕南，胡友梅.粉防己碱外用对小鼠烫伤的治疗作用［J］.中药药理与临床，1997，13(4):17-18.

12 Kohyama T，Yamauchi Y，Takizawa H，Kamitani S，Kawasaki S，Nagase T.Histamine stimulates human lung fibroblast migration［J］.Mol Cell Biochem，2010，337(1-2):77-81.

13张新平.粉防己碱对动脉内膜损伤后血管再狭窄的防治作用及机制［D］.武汉:华中科技大学心血管内科，2006.

14骆 玮，李静敏.青光眼滤过泡瘢痕化临床药物治疗的基础研究［J］.临床眼科杂志，2010，18(2):184-186.

15李金瑛，傅 培，黎晓新.TGF-β2反义寡核苷酸抑制抗青光眼术后滤过泡瘢痕的实验研究［J］.眼科研究，2006，24(3):277-280.