丹参单体、三氟拉嗪对视网膜色素上皮细胞增殖抑制的研究△

高彦军 马景学 安建斌 刘丽娅 马红蕾 赵文静

增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是临床上常见的致盲性眼病之一，也是视网膜复位手术失败(占10% ～20%)的主要原因。近年来玻璃体视网膜显微手术已取得快速发展，但仍难以解决复发性视网膜脱离的问题，复发的原因通常是PVR。而视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)细胞是PVR发病过程中关键性增殖细胞，抑制RPE细胞药物的研究日益受到重视。本研究将丹参单体(IH764-3)和三氟拉嗪两种作用机制不同的药物联合应用，验证其对RPE细胞增殖的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 CO2孵箱:日本Sanyo公司;F-12培养基:美国Hyclone公司;二甲基偶氮唑盐(MTT):美国Sigma公司;丹参单体(IH764-3):中国医学科学院血液病研究所;三氟拉嗪:美国Sigma公司。

1.2 RPE细胞的分离培养与鉴定 RPE细胞的分离培养参考文献［1］，通过酶标法检测特异的细胞角蛋白鉴定，第3-5代细胞用于本实验。

1.3 生长曲线的测定 将RPE细胞制成悬液，以30×109L－1接种于24孔板内，每孔1 mL。轻微震荡使之充分混匀。接种后每隔24 h随机消化3孔，血细胞计数器计数，每孔计数4次，取其平均数，共计8 d。以时间为横坐标，细胞数目为纵坐标，绘制生长曲线。重复3次。

1.4 丹参单体、三氟拉嗪对RPE细胞增殖的影响

1.4.1 实验分组 取生长状态良好的第4代细胞，经2.5 g·L－1胰蛋白酶消化后，以 20 ×106L－1接种于96孔板内，每孔200 μL，每组6孔，轻微震荡使之充分混匀，常规培养48 h后进行分组。每组设6个复孔，全部操作重复2次。

空白对照组:用含有0.1 mol·L－1磷酸盐缓冲液以及含体积分数10%小牛血清的F-12培养液作为空白干预液;丹参单体组:用分别含丹参单体31.70 μmol·L－1(5.0 mg·L－1)、15.85 μmol·L－1(2.5 mg·L－1)、6.34 μmol·L－1(1.0 mg·L－1)和含体积分数10%小牛血清的F-12培养液作为干预液;三氟拉嗪组:用分别含三氟拉嗪20 μmol·L－1、15 μmol·L－1、10 μmol·L－1和含体积分数 10% 小牛血清的F-12培养液作为干预液。

1.4.2 各组RPE细胞抑制率的测定 各组RPE细胞培养48 h后弃培养液，加入含体积分数4%小牛血清的F-12培养液，培养过夜以使细胞达同步化后弃培养液。按以上分组分别加入含体积分数10%小牛血清的含配制好药物浓度的培养液。分别在加药培养24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 后加入 MTT 5 g·L－1，每孔20 μL，37℃下继续培养4 h。此时活细胞内生成大量颗粒状、针状furmazan结晶。吸出培养液，每孔加入DMSO(furmazan溶解液)100 μL微量振荡器振荡5 min，倒置显微镜下观察，见furmazan结晶溶解后立即在DG3022型酶联免疫检测仪(490 nm波长)上检测每个孔的光吸收值(OD)。按以下公式计算药物的抑制率，结果以均数±标准差表示，将所得数据用SPSS 17.0统计分析软件进行相关性回归分析，求丹参和三氟拉嗪的半数抑制剂量(IC50)，用于联合给药实验。细胞抑制率=(对照组吸光度值－实验组吸光度值)/对照组吸光度值×100%。

1.5 丹参单体、三氟拉嗪IC50及联合用药对RPE细胞增殖的影响 应用丹参单体IC50与三氟拉嗪IC50及联合用药，检测其对RPE增殖的影响，具体测定方法同上。

1.6 丹参单体、三氟拉嗪及其联合作用后RPE细胞的形态学的改变 将RPE细胞以40×106L－1接种于预先放置有无菌盖玻小片的24孔板内，每孔1 mL。常规培养48 h后分别给予丹参单体(经计算的IC50)、三氟拉嗪(经计算的IC50)及两者联合剂量(IC50联合)。加药干预120 h后收集在光学显微镜观察。

1.7 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件对丹参单体、三氟拉嗪及其联合应用对RPE细胞增殖抑制率进行样本均数的t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RPE细胞的鉴定 原代及传代RPE细胞免疫组织化学染色倒置显微镜下观察，可见典型的角蛋白网架，表明培养的细胞是RPE细胞，阳性率达100%(图1)。

Figure 1 RPE cells identified by immunohistochemistry(AEC，×400) 免疫组织化学染色鉴定的RPE细胞(AEC，×400)

2.2 生长曲线测定 由生长曲线可看出RPE细胞在接种2 d后开始进入增殖期，此时细胞增殖活跃;5 d后细胞生长缓慢，进入衰退期，细胞数量开始减退(图2)。

Figure 2 Growth curve of RPE cells in vitro 体外培养的RPE细胞生长曲线

2.3 丹参单体、三氟拉嗪及联合用药对RPE细胞增殖的影响 丹参单体、三氟拉嗪及联合用药对RPE细胞增殖的影响见表1-表2，由表1-表2可以看出:丹参单体和三氟拉嗪对RPE细胞的增殖均有抑制作用，呈时间及剂量依赖性，各剂量及各时间点相比差异均有显著统计学意义(均为P＜0.01)。两药的IC50分别为15.22 μmol·L－1(2.4 mg·L－1)和18.09 μmol·L－1。联合用药120 h对 RPE 的抑制率达87.23%，两药的IC50联合应用后各时间点与单用丹参单体或三氟拉嗪的IC50抑制率比较均有提高，差异有显著统计学意义(P＜0.01，表3)。

表1 丹参单体对RPE细胞增殖的抑制作用Table1 Inhibitive effects of IH764-3 on proliferation of RPE cells (inhibitive rate/%)

表2 三氟拉嗪对RPE细胞的增殖抑制作用Table2 Inhibitive effects of TFP on proliferation of RPE cells (inhibitive rate/%)

2.4 丹参单体、三氟拉嗪及其联合用药组RPE细胞的形态学观察 与空白对照组(图3)相比，丹参单体、三氟拉嗪及其联合用药组各时间点光学显微镜观察:RPE细胞呈多角形，细胞核完整，细胞浆丰富，可见色素颗粒，偶见核分裂像，未见明显形态学改变(图4-6)。

Figure 3 RPE cells in control group(Gimsa，×400).图3 对照组RPE细胞(Gimsa，×400)。

Figure 4 RPE cells at 5 days after IH764-3(31.7 μmol·L －1)administration(Gimsa，×400).图4 31.70 μmol·L－1丹参单体应用5 d后的RPE细胞(Gimsa，×400)。

Figure 5 RPE cells at 5 days after TFP(20 μmol·L )administration(Gimsa，×400).图5 20 μmol·L－1三氟拉嗪应用5 d后的RPE细胞(Gimsa，×400)。

Figure 6 RPE cells at 5 days after combined administration of TFP and IH764-3(Gimsa，×400)图6 三氟拉嗪IC50和丹参IC50应用5 d后的RPE细胞(Gimsa，×400)

3 讨论

PVR的发病机制目前尚不明确，但细胞增殖是其发生发展中的一个重要因素。当发生孔源性视网膜脱离后RPE细胞离开其正常位置，进入玻璃体腔及视网膜下，逐渐丧失原来的分化特性，获得巨噬细胞样的特征，最终会转变为纤维母细胞样成纤维细胞。PVR的发生发展中RPE细胞既是增殖的始发细胞，也是最重要的增殖细胞，因而在本实验中我们应用RPE细胞作为实验对象。

细胞的生长和增殖受多种因素的精密调控，其中钙离子和钙调蛋白的作用尤为重要。有研究表明，钙调蛋白抑制剂可抑制体外培养的RPE细胞的增殖［2］。三氟拉嗪是一种噻吩类化合物，已被广泛应用于临床抗精神病，可阻断钙离子与钙调蛋白的结合，并通过钙调蛋白结合蛋白及依赖钙调蛋白的蛋白激酶和磷酸激酶，可逆地调节细胞内周期相关蛋白的磷酸化和去磷酸化，以调解细胞内基因表达。三氟拉嗪可抑制肿瘤细胞［3］、贮脂细胞［4］和体外培养的人晶状体细胞增殖［5］。本实验中我们发现三氟拉嗪可明显地抑制RPE细胞的增殖，并呈剂量及时间依赖性。它对RPE细胞的抑制作用主要在用药3 d后表现出来，这与文献报道的结果相一致［7］。在本实验中未发现典型的凋亡细胞，因此能否诱发RPE细胞凋亡尚待进一步研究。

表3 丹参单体和三氟拉嗪对RPE细胞增殖的抑制作用Table3 Inhibitive effects of TFP combined with IH764-3 on proliferation of RPE cells(inhibitive rate/%)

丹参作为活血化淤药物已广泛应用于临床。丹参单体(IH764-3)是由中国医学科学院血液病研究所从丹参中分离提取出的一种有效单体(相对分子质量为158)，它在抑制胶原蛋白合成、沉积及抗纤维化方面有着显著的药理活性;它能明显地抑制成纤维细胞和活化的贮脂细胞增殖［8-9］，可通过下调H2O2刺激肝星状细胞FAK水平影响MMP213和TIMP21的表达［10］来抑制肝星状细胞增殖并可促进其凋亡［11］。在眼科仅见有报道应用复方丹参治疗眼部缺血性病变［12］，未见有关丹参单体对RPE细胞增殖抑制作用的报道。本研究显示，丹参单体对RPE细胞的增殖具有明显的抑制作用，它的IC50为2.4 mg·L－1，它抑制肝星状细胞的IC50为 20 mg·L－1［11］，表明RPE细胞对丹参单体的抑制增殖作用更敏感，但其抑制RPE细胞的机制还不明确。

以往大多数的研究应用单药，很少评价多药联合的效果，然而PVR的发生是一个多环节、多因素参与及多种机制共同作用的复杂过程，单一的用药很难从根本上抑制PVR的发展。此外，多药联合应用既可以产生协同作用，又可减少单药剂量、毒副作用，取得最佳效果。本实验中丹参单体和三氟拉嗪联合应用可明显抑制RPE细胞的增殖，且在各个时间点均较两药单独应用作用强，差异具有显著统计学意义，表明两者联合应用具有协同作用。

本实验中虽然未明确丹参单体对RPE抑制作用的机制，但与三氟拉嗪联合应用确实起到了抑制作用增强的效果，为以后研究两种药物的联合体内试验提供了一定的实验依据。

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