miR-199a在宫颈癌及宫颈上皮内瘤样病变中的表达及意义

邹阮敏 胡芝 陈昊 张丽芳 张文淼 薛向阳 黄引平

microRNA(miRNA)是一类短的(～22nt)、内源性的、在转录后水平调控基因表达的非编码RNA[1]。许多肿瘤已发现miRNA失调表达，在肿瘤的发生发展中起着关键的调控作用[2]。宫颈癌是女性发病率占第2位的恶性肿瘤。miRNA与宫颈癌的相关研究迄今仅约20篇文献报道。最近发现miR-199a在肿瘤组织存在明显差异表达，提示参与肿瘤发生发展。但miR-199a在不同癌组织存在上调/下调不一致表达现象[3～6]。在宫颈癌研究中不同学者研究结果也不一致[7，8]。另外，miR-199a与宫颈癌诸多临床病理特征的关系少有研究。为此，本研究通过茎环Realtime RT-PCR检测48例宫颈癌组织、12例宫颈上皮内瘤样病变(CIN)及20例正常宫颈组织miR-199a-3p和miR-199a-5p的表达，并分析其表达与宫颈癌临床病理特征的关系，探讨在宫颈鳞癌发生、发展中可能的调控作用及临床意义。

材料与方法

1.实验材料:Trizol试剂购自美国 Invitrogen公司;MMLV反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs、SYBR Mastermix等购自Toyobo;引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

2.标本采集:48例宫颈鳞癌组织取自温州市第二人民医院2009年1～9月间的手术患者，均未行放、化疗。患者年龄31～72岁，中位年龄49.6岁。肿瘤直径＜4cm 19例，≥4cm 29例。肿瘤类型:外生型19例，内生型15例，溃疡型10例，颈管型4例。病理分级:G110例，G214例，G324例。临床分期:按国际妇产科联盟(FIGO)的分期标准，Ⅰ期8例，Ⅱ期26例，Ⅲ～Ⅳ期14例。12例CIN患者年龄28～61岁，中位年龄47.3岁。其中CINⅠ级2例、CINⅡ级5例、CINⅢ级5例。另取同期年龄匹配的子宫肌瘤手术的正常宫颈组织20份做对照。标本离体后30min内置于液氮保存。宫颈癌、CIN诊断及常规病理资料由两位病理科医师盲法阅片后提供。

3.总RNA的提取:取液氮保存的组织标本，在液氮中碾碎至粉状，按Trizol试剂说明书提取总RNA，DEPC处理水溶解RNA。为增加小RNA得率，将异丙醇沉淀步骤改为-20℃沉淀2h以上。检测RNA溶液OD260及OD280吸光值，计算RNA浓度和纯度，OD260/OD280比值＞1.8方可用于检测。1%琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA的完整性。

4.茎环RT-qPCR检测mir-199a表达:根据已报道的茎环RT-qPCR方法，以U6作为内参，分析mir-199a-5p、mir-199a-3p表达[9，10]。表1为相关分析的引物序列。1μg总RNA分别以mir-199a-5p和mir-199a-3p茎环反转录引物进行反转录。为准备定量PCR内参模板cDNA，用相同的总RNA标本以U6 RT引物为反转录引物进行反转录。反转录反应体系为1 μg总RNA、50nmol/L miRNA茎环RT引物(或 U6 RT 引物)、2U RNase inhibitor、5U M-MLV 反转录酶、0.5μmol/L dNTP。反应条件为:16℃ 30min，42℃ 30min，75℃15min，反应结束后-20℃保存。以15μl反应体系进行Realtime定量PCR。miRNA检测反应体系包括:1μl RT产物，1×SYBR Green I Mastermix，0.5μmol/L miRNA特异前向引物、0.5μmol/L反向引物。Real-time定量PCR条件为:95℃ 10 min后，95℃ 15s，60℃ 1min，40循环。Real-time定量 PCR使用Applied Biosystems 7500仪器进行。所有样品做3复孔。PCR产物经8%PAGE电泳分析。记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数即Ct值，以U6作为内参照，采用定量PCR中的相对定量法，以N=2-ΔCt表示目的miRNA的表达相对于内参的变化倍数，其中△Ct=CtmiRNA-CtU6。为增加数据直观性，所有数据均放大1000倍。

5.统计学处理:由于miR-199a-5p和mir-199a-3p的表达数据呈非正态分布，故以中位数和四分位数间距表示。采用SPSS 16.0统计软件的非参数秩和检验进行统计处理。两组间差异分析采用Mann-Whitney U检验，3组及以上差异表达分析采用Kruskal-Wallis H检验，取P＜0.05为有统计学意义。

表1 miRNA茎环RT实时PCR检测相关引物序列

结 果

1.宫颈鳞癌、CIN及正常宫颈组织miR-199a-5p及miR-199a-3p的表达:如miR-199a-5p和miR-199a-3p及U6的realtime PCR产物溶解曲线均为单峰，8%PAGE电泳显示PCR产物为单一条带，说明茎环RT-PCR扩增相应的目的基因(图1)。以U6为内参，宫颈鳞癌组织中miR-199a-5p和miR-199a-3p的相对表达量(N=2-ΔCt)分别为0.68(0.43，1.97)和 2.91(1.90，6.55)，CIN 组织分别为0.87(0.56，1.94)和 3.87(1.99，7.26)，正常宫颈组织分别为2.80(1.75，4.43)和 12.92(6.23，17.95)(图2)。采用非参数秩和检验，宫颈鳞癌及CIN与正常宫颈组织的miR-199a-5p和miR-199a-3p表达差异有显著性(P均＜0.05)，宫颈鳞癌与CIN组织的miR-199a-5p和miR-199a-3p表达差异无显著性(P值分别为0.566和0.679)，提示同一前体起源的miR-199a-5p与miR-199a-3p在从正常宫颈向CIN及宫颈癌转变过程中表达下调。进一步分析miR-199a-5p与miR-199a-3p表达比值发现，miR-199a-5p/miR-199a-3p表达比值在宫颈鳞癌、CIN及正常宫颈组织分别为0.25(0.22，0.28)、0.26(0.22，0.30)及 0.24(0.21，0.27)，差异无统计学意义(P=0.219)。

图1 miR-199a-3p、miR-199a-5p及U6内参 Real-time PCR溶解曲线和8%PAGE电泳图

图2 宫颈鳞癌、CIN及正常宫颈组织中miR-199a-3p及miR-199a-5p表达水平

2.不同临床病理特征的宫颈鳞癌组织中miR-199a-5p与miR-199a-3p表达:不同病理分级的宫颈鳞癌组织中miR-199a-5p的表达存在一定差异(P=0.054)，宫颈鳞癌G3组织中miR-199a-5p的表达量低于G1、G2组织;而miR-199a-3p在不同病理分级的宫颈鳞癌组织中差异不显著(P=0.107);不同年龄、肿瘤直径、肿瘤类型及临床分期的宫颈鳞癌组织中miR-199a-5p、miR-199a-3p表达量的比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)(表2)。

表2 宫颈癌中miR-199a-5p与miR-199a-3p表达和临床病理因素的相关性分析

讨 论

miRNA(microRNA)是近年来在多种真核细胞和病毒中发现的一类非编码蛋白的短序列(21～23个核苷酸)RNA片段，其转录前体(Pri-miRNA)在核内被RnaseⅢ核酸酶Drosha加工成约70个核苷酸长的发夹状的RNA，在Exportin5的帮助下从核内进入胞质，然后在Dicer酶的作用下，单链的miRNA进入一个核糖蛋白复合体miRNP。miRNA通过与靶基因的3'UTR区互补配对，指导miRNP复合体对靶基因mRNA进行切割或者翻译抑制，起着调控基因功能的作用，在肿瘤的发生过程中可作为肿瘤抑制或促进因子发挥枢纽调控效应[1，11，12]。

miR-199a是座落于DNM2基因16号内含子的miRNA，前体结构中的miR-199a-5p为通常称谓的miR-199a，而 miR-199a-3p即为 miR-199a*。最近研究显示，miR-199a-5p和miR-199a-3p在许多肿瘤组织存在明显差异表达。但不同的肿瘤组织miR-199a-5p、miR-199a-3p存在上调/下调不一致表达现象。Ichimi T等[3]研究发现，miR-199a-3p在膀胱癌组织中表达明显下调，发挥抑癌的效应，其靶基因为 Keratin7(KRT7)。Murakami等[6]的结果显示 miR-199-5p、miR-199a-3p 在肝细胞癌中的表达低于正常组织，且表达水平与肝细胞癌的分化程度呈负相关。Nam EJ等[4]的研究也发现严重卵巢癌组织中miR-199a表达下调与预后相关。但Song G等[5]的研究显示胃癌组织miR-199a表达上调。不同肿瘤组织miR-199a-5p及miR-199a-3p表达不一致可能的原因之一是miR-199a和染色体重构复合体SWI/SNF的亚单位Brm通过Egr1双负反馈环导致不同类型肿瘤miR-199a表达的不一致性[13]。但是在宫颈癌组织，不同学者的研究结果也不一致。

Lee JW等[7]报道宫颈癌组织miR-199a-5p及miR-199a-3p表达上调，下调miR-199a表达抑制宫颈癌细胞增殖。然而，Pereira PM等[8]研究显示，miR-199a在宫颈癌组织表达下调。分析其原因，除了miR-199a-Brm双负反馈调节外，选择不同内参也是导致不同结果的原因。Lee JW等采用的是let-7a作为内参，Pereira PM等采用是U6作为内参。已有文献报道let-7a在宫颈癌及非癌组织存在差异表达[14]。为此，本研究采用U6作为内参进行分析。结果表明miR-199a-3p和miR-199a-5p在宫颈癌及CIN组织均明显下调表达。提示miR-199a-3p和miR-199a-5p作为抑癌基因发挥效应。

由于绝大多数pre-miRNA进入胞质后被Dicer加工成短暂存在的长度约22nt的类似于siRNA双链miRNA。双链miRNA解开后，自于pre-miRNA一条臂的成熟miRNA进入RISC中，发挥效应。premiRNA的另外一条臂产生一个长度与miRNA相同的片段-miRNA*常被降解[1]。本研究结果显示，不管是宫颈癌、CIN还是正常宫颈组织miR-199a-5p/miR-199a-3p表达比值均为0.25左右，说明miR-199-5p和miR-199a-3p常同时存在于细胞内，共同发挥调控效应，而miR-199a-3p是更加稳定的miRNA。其原因及在宫颈癌中的作用机制尚需后续进一步研究。

分析miR-199-5p和miR-199a-3p表达水平与宫颈癌多种临床病理特征的关系发现，miR-199-5p表达在不同病理分级的宫颈鳞癌组织存在一定差异(P=0.054)，与其他临床病理因素未见显著性差异。小细胞型(Ⅲ级)宫颈癌的miR-199-5p的表达低于于其他细胞分化类型的标本。上述结果表明，miR-199-5p在宫颈癌组织明显下调表达不但是宫颈癌重要的标志，而且可辅助指示肿瘤组织的分化程度。

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