精氨酸加压素对脓毒症大鼠的肝肾保护作用

杨磊 李晓云 柴琛 乔玮 鲁彦 曹农

脓毒症是指局部感染引起的全身炎症反应综合征(SIRS)，运用液体复苏无效的顽固性低血压和器官功能障碍[1]。是严重创伤、烧伤、大手术后、重症胰腺炎和休克等常见的并发症，进一步发展可导致感染性休克、急性呼吸窘迫综合征和多脏器功能障碍综合征(MODS)[2]。严重脓毒症极易诱导继发多脏器功能损害，其中内毒素通过肠黏膜屏障进入血液是系列病损的始发点。盲肠结扎穿孔诱导的脓毒症易于产生肠道损伤而发生肝、肾功能的下降。脓毒症患者死亡的主要原因是顽固性低血压和多器官功能衰竭[3]。内分泌功能异常是脓毒症的另一重要特点，主要包括肾上腺功能不全和内源性精氨酸加压素(AVP)不足。肾上腺功能不全对血压及器官灌注的影响很小。精氨酸加压素是由下丘脑视上核(SON)和室旁核(PVN)合成分泌的一种九肽激素，其第8位氨基酸是精氨酸，主要储存在神经垂体，其分泌主要受血浆渗透压、血容量及血压调节。几乎所有的脓毒症患者在早期血浆AVP浓度升高，而后期则降低，这一点在脓毒症动物模型中也得到证实[4～6]。AVP在脓毒症发病过程中的这一变化是否影响器官灌注却罕见报道。本实验通过盲肠穿刺法(CLP)复制大鼠脓毒症模型，探讨AVP对器官灌注的影响，为脓毒症的治疗提供实验基础。

材料与方法

1.材料:(1)实验动物:清洁级成年雄性Spargue-Dawley大鼠42只，体重250～300g，购自兰州大学实验动物中心。随机分组。42只大鼠随机分为8组:①假手术组(n=4);②CLP4 h组(n=6):CLP术后4h留血清标本;③CLP8 h组(n=6):CLP术后8h留血清;④CLP12h组(n=6):CLP术后12h留血清标本;⑤AVP-i.c.v组(n=6):术后8h，侧脑室注射AVP(50ng/5μl)0.5h后留血清标本;⑥aCSF-i.c.v组(n=4):术后8h，侧脑室注射人工脑脊液(aCSF)5μl 0.5h后留血清标本;⑦AVP-i.v组(n=6):CLP术后6h静脉泵入AVP(2ng/kg/h)2h;⑧NS-i.v组(n=4):CLP术后6h静脉泵入生理盐水(NS)2h后留血清标本。(2)主要试剂与仪器:精氨酸加压素(AVP)购自Sigma公司;立体定位仪MP-8003购自深圳瑞沃德生命科技有限公司;生物信号记录系统RM6240系成都仪器厂产品;动物呼吸机(DW-2000型，上海嘉鹏科技有限公司)。(3)药品配制:静脉用精氨酸加压素(5nmol)直接溶解于生理盐水;侧脑室微量注射用AVP(50ng)直接溶解于人工脑脊液[aCSF(mmol/L):133.3 NaCl，3.4 KCl，1.3 CaCl2，1.2 MgCl2，0.6 NaH2PO4，32.0 NaHCO3，3.4 glucose;pH 7.4]。

2.实验方法:(1)脓毒症大鼠模型制备:实验前12h禁食，自由饮水。按Shi等报道的方法行CLP致脓毒症手术[7]。腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后固定，碘伏消毒2遍，铺无菌洞巾。沿下腹部腹正中线做1.5cm切口，结扎盲肠根部(避免结扎回肠及盲肠系膜血管)，用16号针头穿刺盲肠2次，并轻轻挤压盲肠，直至有少量粪渣流出，然后将盲肠放回腹腔，逐层缝合腹壁切口，假手术组开腹后仅翻动盲肠。术后于腹部皮下注射无菌生理盐水(30ml/kg)以补充术中体液丢失。(2)侧脑室微量注射:侧脑室微量注射参考文献报道[8]，腹腔注射(氨基甲酸乙酯800mg:α-氯醛糖40mg:四硼酸钠40mg/kg)复合麻醉药后，大鼠仰卧位固定于手术台，行气管插管、右侧股动、静脉和左侧股静脉插管。动脉导管通过压力传感器(P-300B)连接生物信号记录系统(RM6240，成都仪器厂)持续监测机体BP和HR。气管插管接动物呼吸机(DW-3000型)通入富含氧气的空气(10～12ml/kg，60～70次/分)。根据大鼠对疼痛刺激反应通过左股静脉管补充麻醉药。大鼠体温在通过红外灯维持37℃。大鼠头部固定于脑立体定位仪(MP-8003)上，切开颅顶皮肤，剥离顶骨骨膜，用浸生理盐水的棉球压迫止血。用牙科钻在前囟后钻一小孔，参照Paxinos及Watson鼠脑图谱(Paxinos＆ Watson，2007)，以前囟(bregma)为原点，坐标为向后:1.0mm，旁开:1.5mm，颅骨表面向下:4.5mm。借助立体定位仪将微量注射器插入侧脑。每次注射容量为5μl，给药时间超过30s。实验结束后给药部位注射膀胺天蓝2μl做组织学定位，10min后切片做组织学定位验证。剔除注射部位不在侧脑室的结果。(3)指标及检测方法:血浆肝、肾功能检测:应用全自动生化分析仪对留取实验动物血浆进行谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)水平测定。

结 果

1.CLP术后不同时间大鼠肝、肾功能发生的变化。与假手术组相比较，CLP大鼠血浆 ALT、AST、ALP、BUN及Cr随时间延长逐渐升高，术后8h开始有统计学意义;其中，CLP术后8～12h血浆 ALT、AST、ALP、BUN 及 Cr升高更显著(表 1)。

表1 CLP术后不同时间大鼠肝肾功能的变化

2.CLP术后8h中枢给予AVP(50ng)肝、肾功能的变化。为了观察在中枢内补充AVP对大鼠肝、肾产生的影响，我们在CLP术后8 h通过侧脑室注射AVP的方式在大鼠中枢内补充AVP，并检测大鼠血浆ALT、AST、ALP、BUN 及 Cr。和对照组比较，侧脑室注射AVP后血浆 ALT、AST、ALP、BUN及 Cr明显升高(表2)。

表2 CLP术后8h中枢给予AVP(50ng)肝、肾功能的变化

3.CLP术后6h静脉持续泵入AVP[2ng/(kg·h)]2h肝肾功能的变化。为了观察持续通过静脉补充AVP对CLP大鼠肝、肾功能的影响，我们在造模后6h开始通过静脉给药的方式给大鼠持续补充AVP[2ng/(kg·h)]2h，给药后检测血浆 ALT、AST、ALP、BUN及Cr的变化。与对照组比较，静脉补充AVP 2h后，大鼠血浆 ALT、AST、ALP、BUN 及Cr明显降低。

表3 CLP术后6h静脉持续泵入AVP[2ng/(kg·h)]2h肝、肾功能的变化

讨 论

脓毒症是机体对感染的失控应答，即脓毒症发病时，机体启动应答机制，刺激AVP分泌，脓毒症早期血浆AVP浓度升高，血压及器官的灌注维持在正常或稍低水平，随着脓毒症病情的进展，中枢NO产生增加抑制AVP的表达，中枢AVP表达减少，分泌增加，出现AVP的中枢耗竭[9，10]。磁共振检查发现在感染性休克病人代表储存血管加压素的神经垂体T1加权信号丧失，说明在感染性休克发生时，体内储备的血管加压素迅速耗尽可能是血浆浓度下降的主要原因[11]。脓毒症后期，因中枢 AVP耗竭导致血浆AVP浓度下降，血压持续降低，器官灌注不足。

我们在实验中发现，CLP术后4h，脓毒症大鼠肝肾功能维持在接近正常水平，4h以后，脓毒症大鼠肝、肾功能持续受损。可能是因为CLP术后4h内，中枢AVP释放增加，血浆AVP浓度升高，使血压能维持在正常水平，器官灌注正常，肝、肾功能未出现明显受损;CLP术后4h以后，因中枢AVP耗竭，出现失代偿，血浆AVP浓度开始降低，因此血压降低，器官灌注不足，肝、肾功能持续受损。因此我们在CLP术后8h侧脑室微量注射AVP，以期达到改善因AVP不足引起的低灌流状态，然而结果显示，侧脑室微量注射AVP后，与对照组相比，肝、肾功能受损反而加重。其机制尚不清楚，推测可能是中枢AVP增加易化皮质醇的释放，脓毒症时外周皮质醇的增加可促进TNF-α的表达，血浆TNF-α升高进一步加重器官损伤，或者CLP术后8h肝、肾功能因灌注而出现受损，中枢补充AVP后血浆AVP升高，肝、肾的血液灌注有所改善，出现缺血再灌注损伤[12，13]。CLP术后 6h持续给予AVP静脉泵入与对照组相比可明显改善肝、肾功能，脓毒症早期补充外源性AVP可减少中枢AVP的消耗，改善脓毒症大鼠的血压，避免器官灌注不足。上述结果表明AVP对肝肾功能具有保护作用，其保护作用是通过外周升压作用，提高器官灌注，从而减轻脓毒症时低血压导致的肝肾功能损害有关。

1 Mahler DA，Selecky PA，Harrod CG，et al.American College of Chest Physicians consensus statement on the management of dyspnea in patients with advanced lung or heart disease.Chest，2010，137(3):674-691

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8 Stepniakowski K，Budzikowski A，Lon S，et al.Central cardiovascular effects of AVP and ANP in normotensive and spontaneously hypertensive rats.J Auton Nerv Syst，1994，47(1-2):33-43

9 Oliveira-Pelegrin GR，de Azevedo SV，Yao ST，et al.Central NOS inhibition differentially affects vasopressin gene expression in hypothalamic nuclei in septic rats.J Neuroimmunol.，2010，227(1-2):80-86

10 Oliveira-Pelegrin GR，Aguila FA，Basso PJ，et al.Role of central NO-cGMP pathway in vasopressin and oxytocin gene expression during sepsis.Peptides，2010，31(10):1847-1852

11 Sharshar T，Carlier R，Blanchard A，et al.Depletion of neurohypophyseal content of vasopressin in septic shock.Crit Care Med，2002，30(3):497-500

12 Zelena D，Langnaese K，Domokos A，et al.Vasopressin Administration into the Paraventricular Nucleus Normalizes Plasma Oxytocin and Corticosterone Levels in Brattleboro Rats.Endocrinology，2009，150(6):2791-2798

13 宋新明，王吉甫.皮质醇导致脓毒症大鼠tnf-α释放增加.中国病理生理杂志，1999，15(6):571