D-硝基精氨酸对小鼠肾损伤及氧化应激作用

韩 滨，张丽丽，由振强，辛艳飞，陈云祥，陈国灿，徐潘生，陈 颖，宣尧仙

(浙江省医学科学院安全性评价研究中心，浙江杭州 310013)

D-硝基精氨酸(NG-nitro-D-arginine，D-NNA)在体内可发生手性转化，生成L型对映异构体，而肾是D-NNA发生手性转化的主要器官，约有80%的D-NNA在肾发生手性转化。研究证实，D-NNA手性转化存在两步反应机制:① D-NNA在肾D型氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase，DAAO)作用下氧化脱氨生成α-酮酸;② α-酮酸在转氨酶参与下，通过立体选择性获取氨基生成 L-硝基精氨酸(NG-nitro-L-arginine，L-NNA)，实现手性转化［1－4］。D-NNA的手性转化产物 L-NNA是一氧化氮合酶(nitric oxide sythase，NOS)的抑制剂，NOS活性被抑制后，可减少体内NO生成，而NO是体内一种重要的生物信号分子，具有调节血管阻力、血压、血小板聚集与黏附等多种生物学作用，NO生成减少会引起动物血压长时间升高、肾动脉管腔缩小、动脉管壁的局限性坏死和微细血管堵塞，引起多种病理损伤。前期研究还发现在D-NNA手型转化过程中，会产生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，生理状态的自由基有刺激细胞生长作用，但是当自由基的产生和清除的平衡状态被打破后，自由基大量堆积，会导致氧化应激，引发脂质过氧化，形成脂质过氧化物，对蛋白质、脂肪和核酸均具有损害作用，造成氧化损伤［5］。

ROS和NO减少在肾功能损伤中起重要作用［6－7］。D-NNA在肾手性转化过程中产生的大量ROS和对NOS活性的抑制可能会对肾有损伤作用。为此，本研究通过长期给药，观察D-NNA对ICR小鼠肾损伤作用，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

D-NNA购自Bachem Biosciences公司，用5%葡萄糖超声溶解;NO试剂盒，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，丙二醛 (malondialdehyde，MDA)，谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。全自动血液生化分析仪(Hitachi，日本)。

1.2 动物及分组处理

40只健康ICR小鼠，雄性，体质量18～22 g，清洁级，由浙江省实验动物中心提供。动物合格证号:0010040。饲养于屏障系统动物实验房内，自由饮水摄食，饲料为全价营养颗粒饲料，饮水为城市饮用水经LAWS-2000实验动物反渗透纯水机处理。小鼠随机分为4组，每组10只:5%葡萄糖对照组，D-NNA 150，50 和15 mg·kg－1组，连续 ip 给药 30 d。给药结束次日进行小鼠称重和所有指标的检测检查。

1.3 肾功能检测

给药结束次日，小鼠眼眶采血，3000×g离心10 min得到血清，用全自动生化分析仪测定血清肌酐(creatinine，Crea)以及血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平。

1.4 肾系数的测定

小鼠手术分离取肾，除去周围结缔脂肪组织，用冷生理盐水冲洗，除去血液，滤纸拭干，电子天平精确称重，按下述公式计算肾系数:

肾系数(mg·g－1)=肾质量(mg)/体质量(g)。

1.5 肾NO水平的检测

取1 g肾组织加入9 ml生理盐水于玻璃匀浆管中制成10% 组织匀浆，于4℃ 12 000×g离心20 min，取上清，按照试剂盒说明采用分光光度法进行NO指标检测。

1.6 肾MDA水平、比色法检测肾GSH-Px和SOD活性的测定

取制备好的肾组织匀浆上清液，按照说明书硫代巴比妥酸法检测肾组织匀浆的MDA含量、以比色法检测GSH-Px和SOD活性。

1.7 组织病理学观察

肾用体积分数为10%甲醛固定48 h，经常规取材，脱水后石蜡包埋，制片，HE染色，在光镜下检查。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 D-硝基精氨酸对小鼠血清肌酐和尿素氮水平的影响

表1结果显示，与5%葡萄糖对照组比较，血清中BUN随D-NNA剂量的增加而增加(P＜0.05);D-NNA 150 和 50 mg·kg－1组 Crea明显升高(P ＜0.05)，D-NNA 15 mg·kg－1组无显著变化。

2.2 D-硝基精氨酸对小鼠肾系数的影响

与5%葡萄糖对照组肾系数(17.74±0.69)mg·g－1相 比，D-NNA 150 mg·kg－1组 肾 系 数(16.74 ±0.55)mg·g－1明显降低(P ＜0.05)，D-NNA 50和15 mg·kg－1组肾系数无明显差异，分别为17.64 ±1.19和(17.49 ±1.17)mg·g－1。

表1D-硝基精氨酸(D-NNA)对小鼠血清尿素氮(Crea)和尿肌酐(BUN)水平的影响Tab.1 Effect of NG-nitro-D-arginine(D-NNA)on serum creatinine(Crea)and blood urea nitrogen(BUN)levels of mice

2.3 D-硝基精氨酸对小鼠肾组织中NO水平的影响

与5%葡萄糖对照组小鼠肾组织中NO水平(12.8 ± 1.2)μmol·L－1相比，只有 D-NNA 150 mg·kg－1小鼠肾组织中 NO 水平为(10.2 ± 2.6)μmol·L－1，明显降低(P ＜ 0.05)，D-NNA 50 和 15 mg·kg－1组肾组织中NO水平无明显差异，分别为(11.4 ±2.2)μmol·L－1和(12.2 ±1.6)μmol·L－1。

2.4 D-硝基精氨酸对小鼠肾MDA水平和GSH-Px及SOD活性的影响

如表2所示，与5%葡萄糖对照组相比，D-NNA 50和150 mg·kg－1组 MDA 水平和 SOD 和 GSH-Px活性明显升高(P ＜0.01，P ＜0.05)，D-NNA 15 mg·kg－1组无显著差异。

表2D-NNA对小鼠肾丙二醛(MDA)含量，谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)及超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响Tab.2 Effect of D-NNA on the level of renal malondialdehyde(MDA)，superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase(GSH-Px)activities of kidneys of mice

2.5 D-硝基精氨酸对小鼠肾组织的作用

光镜检查发现，5%葡萄糖对照组小鼠肾小球、肾小管结构清晰、形态正常，无异常病理表现(图1A)。D-NNA给药组小鼠肾产生一定的病理形态变化，D-NNA 15和50 mg·kg－1主要表现为炎症细胞浸润(图1B，C)。D-NNA 150 mg·kg－1组主要表现为肾小管损伤，嗜碱性变、萎缩或囊性扩张，间质炎性浸润(图1D)。

图1 D-硝基精氨酸对小鼠肾组织的作用.动物分组及给药见表1.A:5%葡萄糖对照组，肾组织结构正常;B:D-NNA 15 mg·kg－1组，间质炎性浸润(箭头所示);C:D-NNA 50 mgp·kg－1组，间质炎性浸润(箭头所示);D:D-NNA 150 mg·kg－1组，肾小管损伤，间质炎性浸润.Fig.1 Effect of D-NNA on kidney morphology of mice.

3 讨论

Crea和BUN是肾功能的主要指标，如果肾功能受损，排除尿素的能力自然下降，血液中 Crea和BUN水平就会升高。本实验对ICR小鼠给予D-NNA 150和 50 mg·kg－1后，小鼠血清中 Crea和BUN的含量明显升高，表明D-NNA对肾功能具有损伤作用，肾病理学检查同样证实长期给予D-NNA会引起肾病理改变。

研究表明，肾是D-NNA在体内发生手性转化的主要器官，在手性转化过程中产生了大量对肾有损伤的 ROS［8－9］，ROS 可以和细胞大分子反应，导致脂质过氧化。脂质过氧化可能导致膜损伤，SOD和GSH-Px 是机 体 主要 的抗 氧 化 酶［10－12］，SOD 和GSH-Px水平反映机体抗氧化能力。MDA是脂质过氧化的产物，通过MDA含量可以反映脂质过氧化程度［13］。本实验给予 ICR小鼠 D-NNA 150和50 mg·kg－1后，小鼠肾组织MDA水平明显升高，SOD活性和GSH-Px活性明显下降，表明D-NNA对肾具有一定的氧化损伤作用。

L-NNA是D-NNA发生手性转化的产物，L-NNA是一种 NOS抑制剂，在体内 NO是由 NOS催化L-NNA氧化生成，NO作为体内的重要信号分子，它能舒张血管，抑制血小板黏附、聚集，抑制白细胞黏附、浸润，减轻炎症介导的细胞坏死，从而保护组织细胞。本实验长期给予 ICR小鼠 D-NNA 150 mg·kg－1后发现，肾NO水平明显降低，在生理条件下释放的NO使血小板处于较低水平的活化状态，防止其黏附聚集，NOS活性受到抑制使NO合成减少，导致血小板活化，并释放血栓素、5-羟色胺、腺嘌呤核苷酸、血小板源性生长因子等引起血管收缩，平滑肌细胞增生并向内膜下迁移，白细胞向内膜黏附，破坏内皮细胞功能［14］，当内皮细胞功能破坏时，局部血管收缩，血小板黏附、聚集功能增强，血液黏滞性增高，加重微循环障碍，增加外周阻力，导致血压升高［15］从而对肾造成损伤作用。

D-NNA的手性转化产物L-NNA能抑制NOS活性导致NO生成减少，手性转化过程中产大量ROS，而哺乳动物对外源物进行生物转化过程中产生的活性氧自由基能够破坏机体的抗氧化防御系统［16］，使机体受到超氧游离基的攻击造成组织细胞损伤［17－18］。肾是D-NNA发生手性转化的主要器官，约有80%D-NNA在肾发生手性转化，对肾造成的损伤较大，所以使小鼠肾质量和肾系数变小。

综上所述，本研究发现，长期给予D-NNA对小鼠肾具有一定的损伤作用，且存在一定的剂量关系，其氧化应激的机制与D-NNA的手性转化产物L-NNA导致NO合成减少，造成肾血管系统功能病变以及在转化过程中产生的ROS有关。

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