高效液相色谱法测定他米巴罗汀胶囊的含量

石 涛，石 滨，陈一辰

(1.东南大学 附属中大医院，2.南京医科大学 附属妇幼保健院，3.中国药科大学，江苏 南京 210009)

急性早幼粒细胞性白血病(APL)是白血病中最危重、病程发展迅速、早期死亡率最高的一种亚型，是一种特殊类型急性髓系白血病[1]。APL患者存在染色体t(15∶17)易位，形成 PML-RARα融合基因，阻碍 PML和 RARα机能，抑制骨髓细胞分化[2-4]。目前，全反式维甲酸(ATRA)与化疗药物联合应用是当前APL的一线及标准治疗方法，但其快速发展的耐药与高复发率是影响长期疗效的两大障碍。他米巴罗汀是由日本新药株式会社研制、针对ATRA的耐药性而开发的一个新的RAR促进剂，它显示了对ATRA缓解后复发的APL具有显著有效性[5]。本研究中采用高效液相色谱法(HPLC)测定他米巴罗汀胶囊含量，旨在为他米巴罗汀的质量控制提供依据。

1 仪器与试剂

岛津LC-10AT泵;岛津SPD-10A紫外检测器;HW-2000色谱工作站。

他米巴罗汀胶囊(批号:20080609，20080611，20080613)，南京威尔曼药物研究所提供;他米巴罗汀对照品(批号:0801)，中国药科大学提供;乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液 取胶囊内容物，精密称取适量，加流动相溶解并定量稀释成每1 mL中约含他米巴罗汀20 μg的溶液，作为供试品溶液。

2.1.2 对照品溶液 精密称取他米巴罗汀对照品适量，用流动相溶解稀释，制成20 μg/mL的溶液，即得。

2.1.3 辅料空白溶液 取本品处方量的空白辅料置10 mL量瓶中，加流动相至刻度，超声5 min，滤过，取续滤液作为辅料空白溶液。

2.2 色谱条件及色谱图

色谱柱:CEC-C8柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈-0.1% 磷酸-甲醇(1∶1∶1);流速:1.0 mL/min;检测波长:235 nm;进样量:20 μL。

分别取供试品溶液、对照品溶液和辅料空白溶液20 μL照上述色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1。理论板数按他米巴罗汀峰计算不低于2500，他米巴罗汀峰与其相邻杂质峰的分离度应符合要求。

图1 他米巴罗汀HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of tamibarotene

2.3 线性试验

取他米巴罗汀对照品适量，精密称定，用流动相溶解并定量制成每1 mL中约含他米巴罗汀2.5，5，10，20，40 μg/mL 的溶液，照高效液相色谱法试验。以浓度(C)为横坐标、峰面积(A)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程:A=38936 C+3391，r=0.9999。他米巴罗汀在 2.51 ～40.12 μg/mL 浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 重复性和中间精密度试验

取胶囊(批号:20080609)内容物，研匀，精密称取适量，配置成浓度为20 μg/mL的供试液。分别取对照液和供试液各20 μL注入液相色谱仪，按外标法计算含量。重复6次。试验结果表明:本法重复性较好。

取胶囊(批号:20080609)内容物，研匀，精密称定适量，按重复性试验项下的方法，由不同的操作者、用不同的仪器、在不同的时间测定本品的含量。结合上述重复性试验结果的数据，计算本法的中间精密度，结果的RSD为0.73%，表明本法中间精密度良好。

2.5 回收率试验

分别精密称取他米巴罗汀对照品16，20和24 mg(约相当于 10倍处方量的 80%，100%，120%)放入研钵中，分别加入10倍处方量辅料，研匀;分别精密称取适量(约相当于他米巴罗汀2 mg)用适量流动相溶解，超声5 min，稀释为10 mL，滤过，续滤液作为供试品溶液。另精密称取他米巴罗汀对照品适量，用流动相溶解并定量制成每1 mL中约含20 μg的溶液作为对照液。依高效液相色谱法进行测定。外标法计算回收量及回收率，回收率均值为99.60%，RSD为0.57%，证明本法回收率较高，辅料对主药的测定无影响。

2.6 最低检测限试验

取对照品溶液，加流动相溶解并制成含他米巴罗汀0.01 μg/mL 的溶液，取 20 μL 注入色谱仪，记录色谱图。此时主峰峰高约为基线噪音的3倍，计算最低检测限为0.2 ng。

2.7 溶液稳定性考察

取胶囊(批号:20080609)内容物研匀制得的粉末适量，用流动相制得浓度为20 μg/mL的供试液，分别于0，1，2，4，6，8 h 进样，记录色谱图，考察溶液的稳定性，结果表明，本溶液在8 h内稳定。

2.8 含量测定

精密称取胶囊内容物研匀制得的粉末适量，加流动相制得浓度约为20 μg/mL的供试液;另精密称取对照品适量，用流动相制成20 μg/mL的对照品溶液。取对照品溶液和供试品溶液各20 μL注入液相色谱仪，按外标法计算含量。3批样品(批号:20080609，20080611，20080613)的含量分别为相当于标示量的 98.68%，99.22%和 99.97%。

3 讨论

他米巴罗汀是一种有机酸，分子的极性较强。在本实验中选用了反相色谱系统，在选择色谱柱时，比较了 Kromasil C18柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm)和CEC-C18柱 (150 mm ×4.6 mm，5 μm)，前者他米巴罗汀在37.136 min出峰，保留时间较长，而后者他米巴罗汀在13.014 min出峰，因此选择CEC-C18柱。在选择流动相时，由于C18链在水相中不易保持伸展状态，故流动相中有机溶剂的比例应不低于5%。经过多次试验，选择乙腈-0.1%磷酸-甲醇(1∶1∶1)为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为235 nm。这种色谱条件既可以使他米巴罗汀在色谱柱上有适当的保留时间，又可以有效地消除有关物质和辅料的影响，优于文献报道的方法[6]。试验结果表明，采用本法测定他米巴罗汀的含量，操作简便、结果准确可靠、重现性好、专属性强，可用于他米巴罗汀胶囊的质量控制。

[1]刘春燕.急性早幼粒细胞白血病的克星——全反式维甲酸[J].开卷有益:求医问药，2007(3):10.

[2]Kazunori O.PML-RARα inhibitors(ATRA，tamibaroten，arsenic troxide)for acute promyelocytic leukemia[J].Jpn Soc Clin Oncol，2007(12):313-317.

[3]王杰松，陈志哲.急性早幼粒细胞白血病的治疗现状[J].医学综述，2007，13(11):838-840.

[4]杨立平.他米巴罗汀药理学研究进展[J].中华临床医学杂志，2008，9(7):57-60.

[5]赖树清，须 媚.急性早幼粒细胞性白血病治疗药——他米巴罗汀(tamibarotene)[J].世界临床药物，2007，28(4):252-253.

[6]张丽华，黄仁杰.他米巴罗汀胶囊制备及其含量测定[J].今日药学，2010，20(10):10-12.