妊娠期高血压疾病患者外周血共刺激分子PD-1的表达及临床意义

吕敬媛,王 丹,赵玉楠

(佳木斯大学附属第一医院妇产科,黑龙江佳木斯 154003)

妊娠期高血压疾病(hypertensive disorders in pregnancy)是妊娠期特有的疾病。该病严重影响母婴健康,是孕产妇和围产儿病率和病死率的主要原因。至今病因未明[1]。从免疫学观点看,妊娠被认为是成功的自然同种异体移植,正常妊娠的维持有赖于胎儿母体间免疫平衡的建立和稳定,如这种平衡被打破,即可导致发生免疫排斥反应,从而引起一系列的血管内皮细胞损伤,进而发生妊娠期高血压疾病[2～4]。PD-1作为新近发现的 CD28家族重要成员,已被证实通过抑制T细胞的活化和增殖来负调控免疫应答[5],并且在调节免疫耐受以及肿瘤免疫逃逸等中发挥重要作用。因此,本研究用流式细胞术测定妊娠期高血压疾病患者外周血和双阳性细胞比例,探讨PD-1在妊娠期高血压疾病发病中的作用及意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

所有对象均选取2009—07～2010—06在我院妇产科就诊及住院的妊娠妇女。其中妊娠期高血压疾病患者37例,平均年龄(26.4±4.2)岁,平均孕龄(35.3±4.1)周。包括重度子痫前期患者10例,轻度子痫前期患者12例,妊娠期高血压患者15例,正常妊娠组15例,平均年龄(25.2±3.7)岁,平均孕龄(36.5±4.6)周。各组病例年龄及孕龄比较均无显著性差异。诊断及分类标准根据乐杰主编《妇产科学》第7版[1]。孕妇均为初孕妇单胎妊娠,既往无原发性高血压、糖尿病史,无反复流产史,心肝肺肾功能正常,未经生殖技术帮助,无免疫性疾病,未经免疫药物治疗。

1.2 实验试剂

流式细胞检测所用单抗及同型对照抗体:PE-cy5标记人CD4单抗,FITC标记人PD-l单抗;PE-cy5标记人和FITC标记人IgGI同型对照抗体,均购自EB公司。

1.3 方法

1.3.1 血标本采集及外周血PBMC分离

分别抽取各组研究对象前臂肘静脉血3mL(妊娠期高血压疾病患者均于住院治疗前抽血),采用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。将制成的单个核细胞悬液在12h内送流式检验和双阳性细胞百分比。

取单个核细胞悬液,将其分成4份,每份150μ L,加流式单抗或同型对照抗体:(l)空白管:加20μ L PBS;(2)同型对照1:加10μ L PE-Cy5标记人CD4单抗和10μ L FITC 标记人同型对照抗体;(3)同型对照2:加 10μ L PE-Cy5标记人同型对照抗体和 10μ L FITC标记人 PD-1单抗;(4)测定管:加PE-Cy5标记人CD4单抗以及FITC标记人PD-1单抗。4℃孵育30min,加1mL PBS1000r/min离心8min洗涤,共洗涤二次;加200μ L PBS重悬细胞,上机检测。以各自的同型对照管参数设门,将测定管参数减去同型对照背景,则为测定管参数值。以相关配套软件计算和+双阳性细胞比例,结果以百分比(%)表示。

1.4 统计学处理

实验结果以均数±标准差(±s)表示,以SPSS13.0软件中的单因素方差分析(One-Way ANOVA),各组两两比较用q检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

表1 各组PBMC中CD4+和CD4+PD-1+细胞比例(±s)

表1 各组PBMC中CD4+和CD4+PD-1+细胞比例(±s)

★与正常妊娠组相比(P＜0.05),▲ 与妊娠期高血压组相比(P＜0.05),● 与轻度子痫前期组相比(P＜0.05)。

组 别 n CD+4(%) CD+4PD-1+(%)正常妊娠组 15 21.87±1.23 3.89±0.73妊娠期高血压组 15 21.90±1.20 9.50±1.02★轻度子痫前期组 12 22.80±0.91★▲ 17.90±2.13★▲重度子痫前期组 10 25.27±0.99★▲● 25.60±3.02★▲●

3 讨论

从现代免疫学观点看,妊娠是母胎免疫系统相互作用的过程,胎儿携带有父源性抗原,对母体的免疫系统来说是一种半同种移植物,正常妊娠是母体免疫系统对胎儿的免疫耐受过程。一旦母胎间免疫耐受平衡失调,便可导致免疫排斥反应,从而发生妊娠失败及某些妊娠并发症,如妊娠期高血压疾病、习惯性流产等。目前大量的研究表明妊娠期高血压疾病与免疫系统存在密切的关系。在妊娠期高血压疾病形成过程中,免疫系统和免疫细胞起到了重要作用。在妊娠期高血压疾病形成和演变中不同的T淋巴细胞亚群起不同的作用,其中对其发生起优势作用的T细胞类型是CD4阳性T辅助细胞(Th)。PD-1是表达在激活状态的 T、B细胞上的一种协同性信号调节分子,属于免疫球蛋白(Ig)超家族成员,与以前发现的CTLA-4有相似性,属于负性调控的协同信号分子,表现对激活后T、B细胞炎症程度的下调和炎症范围的限制[6]。与CT LA-4表达时限的区别是PD-1表达的时限相对较晚,持续时间长,现有研究发现PD-1多表达在慢性感染性疾病或者自身免疫性疾病的炎性细胞表面,其配体主要有PD-Ll和PD-L2,PD-1与其配体结合后介导对免疫细胞周围性耐受,能下调其炎症反应程度。缺乏PD-1受体的T淋巴细胞(无论是还是细胞)的增殖能力和分泌细胞因子功能均显著增强,并且基本不表现凋亡,不能介导周围性耐受[7]。PD-1在妊娠期高血压疾病病人外周血PBMC中的表达情况,目前尚无明确结果。本研究用流式细胞方法测定了妊娠期高血压疾病患者外周血PBMC中CD4和PD-1的表达水平,并与正常妊娠组进行了对比分析。结果发现,妊娠期高血压疾病患者细胞比例增多,重度子痫前期组患者其比例增加更明显,与文献报道结果一致。与其他报道不同的是,本研究检测了不同类型的妊娠期高血压疾病患者外周血细胞上PD-l表达的水平,即 PBMC中比例。结果发现,与正常妊娠组比较,在妊娠期高血压疾病各组双阳性细胞比例均较对照组增高,由文献可知PD-l是在T细胞激活以后表达的负性调控表面分子,故结合本研究结果推测细胞高表达PD-1其作用可能是反馈性抑制细胞的过度激活。这对深入研究妊娠期高血压疾病的机制展现了一个窗口,对临床治疗提供了一个潜在的靶标。但是PD-1对妊娠期高血压疾病影响的直接证据还有赖于进一步的研究。

[1]乐杰主编.妇产科学[M].第7版,北京:人民卫生出版社,2008,92-94

[2]Redmancw G,Sargenti L.Latest advances in understanding PreeclamPsia[J].Science,2005,308(5728):1592-1594

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