米曲霉产中性蛋白酶提取与粗酶性质研究

蒋爱凤,胡喜巧,李兰

（河南科技学院,河南新乡 453003）

中性蛋白酶作用条件温和,是最早发现并广泛应用于工业化生产的蛋白酶制剂[1],可应用于食品、制药、化妆品以及丝纺等行业[2].其中,在食品中可用于饼干、面包、面条的生产与加工、酒类发酵、啤酒、果汁饮料澄清、酱油的酿制等,也可用来水解各种蛋白质以获得多肽或氨基酸.中性蛋白酶生产既可以从动植物组织中提取,也可以通过微生物发酵工艺进行生产,将植物作为蛋白酶的来源会受到一些诸如气候条件,以及可利用土地面积的大小等因素的影响,并且从植物中提取蛋白酶是一个极其耗时的过程,而以动物作为蛋白酶的来源,其产量的大小主要依赖于可被屠宰牲畜的数量.由于从植物和动物中生产蛋白酶具有局限性,人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶上,微生物由于生长速度快、所需空间狭小、广泛的生化多样性及其遗传可操作性等特点,因而备受人们青睐.据统计,微生物蛋白酶占据了世界整个酶销售市场约40%的份额,已成为市场上蛋白酶生产的主要来源.

米曲霉Aspergillus oryzae是美国食品药物管理局（FDA）公布的40余种安全微生物菌种之一[3],米曲霉的酶包括蛋白酶、淀粉酶、肽酶、谷氨酰氨酶、脂肪酶、果胶酶、转化酶、纤维素酶及麦芽糖酶等酸、中、碱性酶,其中起关键作用的是蛋白酶.张淑娟[4]、Padmanabhan[5]、Fushimi[6]等对米曲霉中性蛋白酶部分特性进行了研究,但仍未见系统的研究文献,尤其是在酶的提取方法方面.

从酿造白酒的大曲中分离纯化得到米曲霉菌种,系统地研究了该酶的提取方法以及温度、盐度、pH、乙二胺四乙酸（EDTA）等对米曲霉中性蛋白酶活力的影响,并研究得出该酶的米氏常数Km及其最大反应速率Vmax,以期能够为工业生产提供理论参考依据.

1 材料和方法

1.1 菌种和培养基

米曲霉：河南某白酒厂白酒大曲中分离纯化得到.培养基：查氏培养基[7].

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1 试剂 除酪蛋白（浙江富阳杭富生物制品厂）为生化试剂外,其他药品均为分析纯试剂.麦麸、黄豆粉为市购.

1.2.2 仪器 YXQG02型手提式灭菌锅（山东安得医疗科技有限公司）,BCM-1000型超净工作台（苏州净化设备有限公司）,HH-SYZ1-NI型数显恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司）,722型分光光度计（上海第三分析仪器厂）.

1.3 培养方法

1.3.1 米曲霉菌种分离 将白酒大曲研磨成粉状,制成菌悬液,并对其进行梯度稀释,并涂布平板,30℃培养5 d,根据菌落的生物学特征,筛选出目的菌株米曲霉.将米曲霉挑取单菌落接种于斜面培养基,30℃培养5 d,斜面长好后放入冰箱保存待用.

1.3.2 固体培养 在无菌超净工作台中接3环斜面菌种于三角瓶麸皮豆粕固体培养基中,充分摇匀.于30℃恒温培养箱中培养,并分别于24 h和48 h各扣瓶,共培养72 h.

1.4 分析方法

1.4.1 酪氨酸标准曲线的绘制 取试管编号按照表1配置各种不同浓度的酪氨酸溶液,后分别吸取不同浓度的酪氨酸1mL于相应试管中,再各加入0.4mol的Na2CO3溶液5mL,加入已稀释3倍的Folin-酚试剂1mL.摇匀后置于水浴锅中,40℃保温反应20min,用722型分光光度计在660 nm下进行测定.试验做3次重复,用蒸馏水做空白对照.所测得的光密度为净OD值.以净OD值为横坐标,酪氨酸的浓度为纵坐标,绘制出的标准曲线见图1.

图1 酪氨酸标准曲线

表1 配制各种不同浓度的酪氨酸溶液试剂

1.4.2 中性蛋白酶活力测定：Folin-酚法[8]

1.4.3 粗酶液的制备 将发酵好的培养物于40℃恒温箱中烘干,并用研钵研磨成细粉.称取固体样品各5 g于3个烧杯中,然后分别向3个烧杯中各加入100mL生理盐水、pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液、蒸馏水.分别用玻璃棒搅拌均匀,置30℃恒温水浴锅中浸取30min,每10min搅动1次,用低速离心机（转速为4000 r/min）离心20min取上清,即为粗酶液[9]。

1.4.4 粗酶的硫酸铵沉淀提取 设置不同浓度梯度的硫酸铵溶液,对所分离的粗酶液进行作用,通过测定酶活力来确定硫酸铵沉降中性蛋白酶的浓度[10].

1.4.5 酶学性质研究 设置不同的温度梯度、作用时间梯度、pH梯度、氯化钠浓度梯度、EDTA浓度梯度对粗酶液进行反应,通过测定酶活力,对酶的最适作用温度、酶的热稳定性、最适作用pH值及pH值稳定性、中性蛋白酶的耐盐性、EDTA对酶活性的影响进行研究.并对蛋白酶的米氏常数（Km）进行确定.

2 结果与分析

2.1 提取方法对酶活力的影响

将用3种不同溶液提取方法得到的粗酶液,再用pH为7.2的磷酸盐缓冲液适当稀释,稀释倍数为0、2、4、6倍,每个稀释倍数做3次重复,分别测酶活力,以确定该中性蛋白酶的最佳提取方法.结果见表2.

表2 不同提取方法测得的单位酶活力

从表2可见,在3种提取方法及各个稀释倍数中,用生理盐水提取测得的单位酶活力值最大,故效果最好,pH7.2缓冲溶液提取效果次之,蒸馏水提取的效果最差.本试验也说明了稀释2倍时提取效果较稳定.故选择用生理盐水并稀释2倍作为制取粗酶液的方法.

2.2 硫酸铵沉淀蛋白酶最适浓度的选择

取25mL刻度试管分别称入0、1.40 g、2.85 g、4.40 g、6.07 g、7.83 g、9.75 g、11.80 g、14.03 g、16.55 g的硫酸铵用浸提后未稀释的粗酶液定容至25mL,配制成0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的硫酸铵溶液,置于4℃冰箱中过夜.4000 r/min离心10min去除固形物.分别取上清液测定各个试管中残余中性蛋白酶酶活力,以确定硫酸铵沉降中性蛋白酶的浓度.以未加硫酸铵处理的酶活力为100%作为对照,计算相对酶活力.以硫酸铵浓度为横坐标,以相对酶活力为纵坐标作图2.

从图2可以看出,粗酶液中残余的中性蛋白酶相对酶活力随着硫酸铵饱和度的提高而减小,故随着硫酸铵浓度的增加,中性蛋白酶的提取效果越好.由图显示：沉淀中性蛋白酶的硫酸铵浓度应为80%.

2.3 酶学性质研究

2.3.1 酶的最适作用温度及酶的热稳定性

图2 硫酸铵浓度对蛋白酶沉淀的影响

2.3.1.1 酶的最适作用温度 将用pH为7.2的磷酸盐缓冲液稀释好的粗酶液分别在35℃、40℃、45℃、50℃ 、55℃ 、60℃ 、65℃ 、70℃的条件下与1%酪素底物反应10min,其余条件相同,测定中性蛋白酶酶活力.以55℃处理下的酶活力为100%作为对照,计算相对酶活力.以相对酶活力为纵坐标,酶的作用温度为横坐标作图3.

从图3可以看出：55℃时相对酶活力达到最大,60℃酶活力开始下降.因此,米曲霉中产中性蛋白酶作用的最适温度为55℃.2.3.1.2酶的热稳定性 取用pH为7.2的磷酸盐缓冲液稀释好的粗酶液于40℃、50℃、60℃恒温条件下分别保温 0min、20min、40min、60min、80min、100min 后立即冰浴,根据 Folin- 酚法,测定中性蛋白酶酶活力.以处理时间为0min的酶活力为100%作为对照,计算相对酶活力.以相对酶活力为纵坐标,酶作用时间为横坐标作图4.

图3 酶的最适作用温度

图4 酶的热稳定性

从图4可以看出,40℃的酶活力相对稳定,处理80min时,相对酶活力仍保持了62.15%,但当处理到100min时,酶活力迅速下降,说明在保温80min以后,酶蛋白开始迅速变性.50℃下处理60min只保持了相对酶活力的41.5%,处理到80min时,粗酶中几乎检测不到酶活力,60℃下处理20min时相对酶活力只有3.62%.这说明该中性蛋白酶不耐高温处理.

2.3.2 酶的最适作用pH值及酶的pH值稳定性将酶液分别用 pH 值分别为 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的0.1mol/L磷酸缓冲溶液进行适当稀释,然后用相应pH缓冲溶液配置干酪素,根据Folin-酚法,测定中性蛋白酶酶的活力.以pH为7.0的酶活力为100%,计算相对酶活力.以相对酶活力为纵坐标,pH为横坐标作图5.

图5 pH对酶活力的影响

由图5的结果,可以看出：在pH为7.0时相对酶活力达到最大.酶的pH稳定性反应了酶的耐酸碱能力.从图 5 可知,在 pH 6.0～8.0 范围,该中性蛋白酶稳定性较好,特别在中性偏酸范围该酶可以保持85.56%以上的相对酶活力.

2.3.3 中性蛋白酶的耐盐性 将酶液用氯化钠分别调至浓度为 4%、8%、12%、16%、20%、24%于40℃保温1 h后,每个浓度做3个重复.根据Folin-酚法,测定中性蛋白酶活力.以NaCl浓度为0%的酶活力为100%作为对照,计算相对酶活力.以相对酶活力为纵坐标,以NaCl浓度为横坐标,可得图6.

从图6可见,NaCl对中性蛋白酶活力有抑制作用,并随着盐度的增高,蛋白酶的相对酶活力逐渐下降,但盐度为24%时,相对酶活力仍有58.82%.所以,我们在食品酿制过程中可以采取分批加入食盐的方法,以使中性蛋白酶的活性不致下降得过快.

2.3.4 EDTA对酶活性的影响 将浸提好的粗酶液用不同浓度的EDTA稀释2倍制成粗酶液,EDTA的浓度在分别为0mmol/L、0.1 mmol/L、0.5 mmol/L 、1 mmol/L、2 mmol/L 、5 mmol/L和10mmol/L,每一个浓度做3个重复.根据Folin-酚法,测定中性蛋白酶活力.以不加EDTA的酶活力为100%作为对照,计算相对酶活力.以相对酶活力为纵坐标,EDTA浓度为横坐标,结果见图7.

从图7可以看出,EDTA对酶活力有一定得影响,并随着EDTA浓度的升高,相对酶活力不断下降.但EDTA的浓度大于5.0 mmol/L后,其变化引起的相对酶活力下降变小.因此,可以推断其中性蛋白酶应具有2种或2种以上的,且其中一种为金属蛋白酶.Fushimi[6]等研究也表明米曲霉中性蛋白酶有2种,其中中性蛋白酶Ⅱ为含Zn2﹢离子金属蛋白酶.

2.3.5 米氏常数的测定 以2%的酪素溶液为母液分别配制 0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的系列标准液各10mL.以酪素为底物,在40℃水浴中,测定不同底物浓度下的酶促反应速率,以S/V-S作图8[11].

由图8可见,该直线方程为y=0.1789x+0.2649,横轴的截距为-Km,斜率为1/Vmax.故结果表明以酪素为底物时,Km值1.51mg/mL,最大反应速率Vmax=5.59mg/min.

图6 NaCl浓度对酶活力的影响

图7 EDTA对酶活力的影响

图8 以Hanes Woolf法作S/V与S的关系

3 结论

（1）米曲霉中性蛋白酶的最佳提取方法为加入生理盐水（发酵干曲：生理盐水＝1：20）,搅拌均匀,置恒温（30℃）培养箱中提取30min,每10min搅拌1次,最后用4层纱布过滤.

（2）硫酸铵沉降中性蛋白酶的最佳浓度为80%.该中性蛋白酶的最适作用温度为55℃,最适pH值为7.0,该酶在40℃下的稳定性较好,50℃处理80min和60℃下处理20min,几乎检测不到酶活力；该中性蛋白酶pH稳定范围为6.0～8.0.

（3）NaCl和EDTA对中性蛋白酶活力具有抑制作用,随着NaCl和EDTA浓度的增高,蛋白酶的活力都逐渐下降,当盐度为24%时,相对酶活力仍有58.82%；但EDTA的浓度大于5.0mmol/L后,其变化引起的相对酶活力下降变小.因此,可以推断其中性蛋白酶应具有2种或2种以上的,且其中一种为金属蛋白酶.

（4）动力学研究表明：以酪素为底物,米氏常数值为1.51mg/mL,最大反应速率Vmax为5.59mg/min.通过以上研究可以得知,中性蛋白酶是一种生物活性物质,易受氧化剂的抑制及破坏作用,在贮存或使用过程中应避免与之接触.米曲霉所产的中性蛋白酶是一种具有前景的饲用酶制剂,可用于食品的加工；对于白酒酿制行业,具有节约粮食,出酒率高,机械化生产周期短等深远意义.

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