不同营养条件对草地螟球孢白僵菌生长的影响

徐忠宝，刘爱萍，吴晋华，黄海广，徐林波，高书晶，乔艳荣

(1.中国农业科学院草原研究所，内蒙古 呼和浩特 010010；2.巴彦淖尔市封育飞播管理站，内蒙古 巴彦淖尔 015000)

球孢白僵菌(Beauveriabassiana)是一种广谱性的昆虫病原真菌,在防治农林害虫上具有较好的应用潜力[1]。球孢白僵菌对农作物和牧草的迁飞性害虫草地螟(Loxostegesticticalis)有一定的寄生作用。曹艺潇和刘爱萍[2]研究表明，在温度为26 ℃，相对湿度为95%的条件下，孢子浓度为1×109个/mL的球孢白僵菌对草地螟的致死速率最快，死亡率最高。人们一直在研发用于防治草地螟的球孢白僵菌制剂，可是生产的白僵菌制剂由于菌种退化以及营养条件不当等原因，目前品质不高，孢子含量太低，从而在一定程度上影响着白僵菌剂的推广和使用效果[3]。除了经常进行虫体复壮、选用优良菌株外，还可以通过改善白僵菌的营养状况来促进孢子大量产生。人们在筛选菌株的同时，还开展其制剂与化学杀虫剂混配的研究，以期提高白僵菌制剂的防治效果[4-5]。营养条件是影响白僵菌菌株生长的重要因素之一，李农昌等[6]指出，不同的营养因素影响着白僵菌的生长及产孢水平，适宜的营养会促进菌株生长，增强杀虫活性。营养贫乏或缺失会导致菌株性状的退化，造成菌落局变等现象，进而影响真菌的活力[7-9]。碳源、氮源、微量元素等营养是白僵菌生长不可缺少的物质和能量来源，只有在一定的营养供应条件下才能够生长和繁殖，只有对其最适的营养生长条件充分了解和认识以后，才能进行有效的大量生产，为完成生物农药的产业化提供重要依据和指导[10]。

自2007年起，在内蒙古自治区主要牧草生产地采集球孢白僵菌，经过室内毒力测定筛选出效果较好的3株菌株。为将其尽快发展为可大量生产的生物农药，本研究分析碳源、氮源以及微量元素对草地螟球孢白僵菌生长和产饱量的影响，旨在筛选出生产高品质球孢白僵菌孢子粉的营养需求。

1 材料与方法

1.1供试材料及培养基

1.1.1供试材料 编号Bb-D01的球孢白僵菌菌株采自兴安盟(代钦塔拉苏木)；编号Bb-S05的球孢白僵菌菌株采自鄂尔多斯市(准格尔旗)；编号Bb-Y03的球孢白僵菌菌株采自乌兰察布市(四子王旗)。

1.1.2基础培养基 KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO40.5 g，Na2HPO40.65 g，H2O 1 000 mL，琼脂20 g。

1.1.3供试培养基

供试碳源共4种(表1)，分别来自有机碳和无机碳。不同碳源在1 000 mL的培养基中的添加量根据各自的全碳含量相对于20 g蔗糖的全碳量折合而成。分别加入到基础培养基中。

供试氮源共4种(表1),分别来自有机氮和无机氮。不同氮源在1 000 mL的培养基中添加量根据各自的全氮含量相对于10 g蛋白胨的全氮量折合而成。分别加入到基础培养基中。

供试氮碳比培养基：选取葡萄糖和酵母浸粉为供试碳源和氮源(依试验结果选取)，进行不同碳氮比对其生长指标影响的测定。每个因素设4个水平(表2)。

微量元素培养基：在基础培养基上以添加微量元素(Cu2+、Fe3+、Zn2+、Mn2)单元素及多元素组合(从4个微量元素中，任取m(2≤m≤4)个元素，按照一定的顺序排成一列，每一列作为一个多元素组合)，各单元素按0.001%添加，多元素组合中每种元素也按0.001%添加入基础培养基。以基础培养基作为对照。

表1 不同碳源全碳含量和氮源全氮含量

表2 不同碳氮比组合

1.2试验方法

1.2.1接种与培养 在无菌操作台中取上述各培养基15～18 mL倒入培养皿(直径9 cm)中，用直径为4 mm的打孔器在培养3 d、生长一致的待测菌菌落边缘打孔，接种于不同的碳源(葡萄糖、蔗糖、碳酸钠和可溶性淀粉)和氮源(蛋白胨、硝酸钾、牛肉膏和酵母浸粉)的培养基中。每处理重复3次，以无糖无氮培养基作为对照，置于(25±1) ℃恒温培养箱中培养15 d。

1.2.2孢子悬浮液的配制 将各菌株接种于基础培养基上，置于(25±1) ℃恒温培养箱中培养，待形成分生孢子后收集于装有无菌水(含0.05%吐温-80)的三角瓶中。经磁力搅拌器搅拌30 min，直到孢子完全被打散再经3层无菌纱布过滤，获得纯孢子悬浮液。再用血球计数板计数配制成试验所需浓度的孢子悬浮液。

1.2.3菌落生长的测量 取孢子浓度1×108个/mL的各菌株孢子悬浮液100 μL，接种于固体培养基的中央，用灭菌玻璃涂棒涂布均匀，放于(25±1) ℃恒温培养箱中培养10 d,采用十字交叉法用游标卡尺每隔2 d测量菌落生长直径，记录并计算其生长率[10]。

1.2.4产孢量的测定 用直径为5 mm的打孔器在菌落(孢子已成熟)的同一位置均匀打孔取菌，放入装有玻璃珠的20 mL无菌水(含0.05%吐温-80)三角瓶中混合均匀,再振荡(200 r/min)20 min,使用血球计数板于光学显微镜(40×)下计数,分别计算其产孢量,每处理5次重复。

1.3数据统计 试验数据利用DPS数据处理系统[11]及Excel 2003软件进行处理、分析。方差分析均采用邓肯新复极差法。

2 结果

2.1不同碳源对各菌株生长指标的测定 有机碳源均能给Bb-D01、Bb-S05、Bb-Y03菌株提供碳源，但生长情况不同(表3)；葡萄糖作为碳源时，萌发率和产孢量最高，萌发率分别可达(79.50±3.00)%、(81.10±2.20)%和(90.22±1.20)%(表3)，产孢量分别可达(0.60±0.18)×108、(0.61±0.32)×108和(0.90±0.10)×108个/mL(表3)，蔗糖次之。各项生长指标以葡萄糖作为碳源时最好，蔗糖次之。

无机碳源碳酸钠作为碳源时，仅能为Bb-S05菌株提供碳源，且各项指标均表现为无机碳源显著低于有机碳源(P<0.05)(表3)。有机碳作为碳源时，最低萌发率为(39.50±2.10)%，无机碳源的最高萌发率仅为(0.10±0.10)%，两者相差390多倍。无机碳源碳酸钠作为碳源时Bb-D01与Bb-Y03菌株均未能萌发。

3个菌株菌落均为乳黄色或乳白色，绒毛状伞形，菌落较厚；Bb-D01 和Bb-Y03菌株放射沟明显，皱褶强烈，Bb-S05菌株无褶皱，有液滴出现。

以上结果表明，试验所选的有机碳源比无机碳源更适合内蒙古自治区草地螟球孢白僵菌的生长，且以葡萄糖为最佳碳源，蔗糖次之，而无机碳源碳酸钠则不适合作为本研究菌株的碳源。形态方面，有机碳源葡萄糖的菌株菌落颜色较深，且菌落厚于其他碳源；生长指标方面，萌发率高、菌丝生长快、产孢量高，各生长指标明显高于其他碳源。

表3 不同碳源对3株菌株的萌发率、生长速率、产孢量的影响

表4 不同氮源对3株菌株的萌发率、生长速率、产孢量的影响

2.2不同氮源对各菌株生长指标的测定 有机氮源和无机氮源均可作为Bb-D01菌株生长所需的能源物质，维持菌株的正常生长(表4)。蛋白胨作为氮源时，菌丝生长最快，达到(3.00±0.20) mm/d，且与其他氮源差异显著(P<0.05)。酵母浸粉作为氮源时，萌发率和产孢量最优，分别为(96.30±0.50)%、(1.15±0.11)×108个/mL。无机氮源的各项指标均显著低于有机氮源的(P<0.05)。

Bb-S05菌株对有机氮源和无机氮源均能利用，且菌丝生长正常。蛋白胨和牛肉膏之间各项生长指标无显著差异(P>0.05)。以酵母浸粉为氮源时，与其他氮源相比促进作用最强，各项指标均最佳。

所选氮源对Bb-Y03菌株效果优良，从萌发率分析有机氮源之间均无显著差异(P>0.05)，但显著高于无机氮源(P<0.05)。从生长速率分析牛肉膏和酵母浸粉之间无显著差异；从产孢量上分析牛肉膏和蛋白胨之间无显著差异，但均显著低于酵母浸粉。其中酵母浸粉菌丝生长速率和产孢量分别为(2.88±0.00) mm/d、(1.00±0.00)×108个/mL，在这两项指标中均处首位。

有机氮源的3个菌株菌落呈乳黄色棉絮状，菌落较厚，有放射沟，同心环明显，无机氮源的均呈现白色粉状、有同心环、无褶皱，菌落薄。

以上结果表明，试验所选的有机氮源和无机氮源不仅适合内蒙古自治区草地螟白僵菌的生长，而且效果良好。从形态特征上分析接种有机氮源上的菌株，一般菌落颜色较深较厚，多呈现乳黄色。无机氮源的菌落多呈现白色粉状或绒毛状，菌落厚度低于有机氮源。从生长指标上分析，球孢白僵菌菌株之间存在的差异可能导致菌丝生长快但产孢量却不一定高的现象。总体来看，有机氮源比无机氮源的萌发率高、菌丝生长快、产孢量高，其中以酵母浸粉的利用最为充分。综合分析各菌株的形态特征和生长指标可以得出：有机氮源酵母浸粉是该地区白僵菌菌株生长的最佳氮源，牛肉膏和蛋白胨次之。

2.3不同碳氮比对各菌株生长指标的测定 3个菌株均可在12个不同碳氮比的培养基中生长，但在生长速度和产孢量上存在差异(表5、6)。菌株Bb-D01在编号2的培养基(C∶N=40∶8)的菌丝生长最快、产孢量最高，分别为(0.66±0.02) mm/d、(1.58±0.04)×108个/mL，C∶N为5∶1的编号7的培养基表现也相对较好，但显著低于编号2(P<0.05)。

菌株Bb-S05以C∶N=5∶1(编号2、7和12)时利用率最佳。其中编号2的菌丝生长最佳、产孢量最高，显著高于编号7和12(P<0.05)，且编号2的菌丝生长速度极显著高于编号12的(P<0.01)，而编号7和12的菌丝生长和产孢量差异不显著(P>0.05)。

菌株Bb-Y03在编号2、7和12三种培养基在菌丝生长和产孢量上相对其他要好，但三者之间差异不显著(P>0.05)。其中以编号2的菌丝生长最好，为(0.60±0.05) cm/d、产孢量最高,为(1.55±0.04)×108个/mL。

2.4不同微量元素对Bb-D01、Bb-S05、Bb-Y03菌株生长指标的测定 以葡萄糖和酵母浸粉为供试碳源和氮源，比例为5∶1，进行不同微量量元素对3个菌株生长影响测定。从表7可知，Bb-D01、Bb-S05、Bb-Y03对微量元素的需求不同,微元素对3个菌株生长的作用与产孢量的影响均存在一定的差异。对Bb-D01而言，除单元素Cu2+对其菌落生长有抑制作用外，其余单元素菌对其均有促进作用，Fe3+、Mn2+组合和Fe3+对Bb-D01菌落生长有较大的促进作用，相互间没有显著差异；从Bb-D01的产孢量看，除Cu2+、Zn2+、Fe3+组合外，其余组合及单元素对Bb-D01产孢量均无促进作用。对Bb-S05而言，单元素对其菌落生长没有促进作用；Cu2+、Fe3+组合，Fe3+、Zn2+、Mn2+组合促进作用较大，并且Fe3+、Zn2+、Mn2+组合对其的促进作用最大,但相互间没有显著差异；所有单元素及多元素组合对Bb-S05的产孢量有增产作用，其中单元素Fe3+增产效果最明显。对Bb-Y03而言，添加任何单元素或多元素组合对其菌落生长均有抑制作用，尤其Cu2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+组合对其抑制作用最大；从菌株产孢量的情况观察，任何单元素或多元素组合对Bb-Y03菌落生长均有抑制作用。

表5 不同碳氮比对3株菌株菌丝生长的影响

表6 不同碳氮比对3株菌株产孢量的影响

表7 微量元素对3个菌株菌落生长和产孢量的影响

因此，综合考虑各微量元素对菌落生长与产孢量影响的差异，实际生产中，对Bb-D01菌株可适当添加Fe3+，应尽量避免加入Cu2+；对Bb-S05、Bb-Y03菌株以不添加任何微量元素为佳。

3 讨论与小结

营养条件是影响白僵菌菌株生长的重要因素之一，营养贫乏或缺失会导致菌株性状的退化，造成菌落局变等现象，进而影响真菌的活力。本研究分别选用4种碳源和4种氮源(无机碳源和无机氮源各一种)及12种不同碳氮比进行初步分析，碳氮源的试验表明，不同的碳源或氮源对内蒙古自治区东、西、中部地区白僵菌的影响显著；不同的碳氮比试验中，对比例相同的配方来说，影响白僵菌菌丝生长和产孢量的因素取决于各配方中碳源和氮源的含量而不是碳氮源的比例。

菌株对有机碳源的利用率高于无机碳源，个别菌株出现不能利用碳酸钠的情况；各菌株对单糖和多糖均能很好的利用，这表明菌丝的淀粉水解酶活性很强，能够顺利地把淀粉水解为葡萄糖。葡萄糖作为碳源时菌株的形态特征表现优良,各项生长指标的参数最高，而陆晴等[12]研究认为球孢白僵菌HFW-05菌株的最适碳源是蔗糖，原因可能是不同菌株所含的单糖水解酶和多糖水解酶水平不同，本研究所选取的球孢白僵菌菌株利用单糖的能力要大于利用多糖的能力。从经济方面考虑，淀粉的价格低于葡萄糖，同时菌株又具有较高的淀粉水解酶，所以在工业生产中可以利用各种植物淀粉作为碳源。

所有菌株均能在不同的氮源试验中正常生长。Peczynska Czoch和Urbanczyk[13]指出营养丰富的氮源可提高白僵菌的萌发及产孢水平,与本研究结果相符，其中以酵母浸粉的各项生长指标最佳，利用率最高；牛肉膏和蛋白胨次之；无机氮源硝酸钾最低，菌株对营养物质吸收利用率也最低。

C∶N为5∶1时，菌株对营养物质吸收利用率最高；其菌丝生长最快，产孢量最高。因此，C∶N=5∶1是该地区菌株的最佳配比。

目前微量元素对球孢白僵菌菌落生长发育影响的相关报道较少，本研究表明，只有Cu2+对Bb-D01菌落生长有抑制作用，而邓春生等[14]在研究一种能寄生大黑鳃金龟子(Holotrichiaoblita)和暗黑鳃金龟子(B.tenella)的卵孢白僵菌(H.parallela)时，培养基中添加单元素Cu2+有利于“单5”菌株的生长，之所以出现结果不一致，可能的原因是本研究所选的是球孢白僵菌，而“单5”菌株所选的是卵孢白僵菌；二者的寄主不同，因此寄主体内的微量元素Cu2+含量也有差异，这有待进一步的研究。另外，Mn2+促进Bb-D01菌落生长，却抑制Bb-S05、Bb-Y03菌落生长；Mn2+降低了Bb-D01的产孢量，却增加了Bb-S05、Bb-Y03的产孢量，这与杨珊珊[15]的添加高锰酸钾能促进白僵菌的产孢量的研究结果一致。可以看出，Mn2+在科学研究和实际应用中，可根据具体情况决定是否添加，如果需要增加Bb-S05、Bb-Y03的产饱量，可以在培养基中适量添加Mn2+。

[1]Bidochka M J,Kamp A M,De Croos J N A.Insect pathogenic fungi:from genes to populations[A]In:Kronstad J W.Fungal Pathology[M].The Netherlands: Kluwer Academic Press,2000:171-193.

[2] 曹艺潇,刘爱萍.不同温湿度对草地螟白僵菌的致病力影响[J].草原与草坪,2010,30(4):68-70.

[3] 季香云,杨长举.白僵菌的致病性与应用[J].中国生物防治,2003,19(2):82-85.

[4] Andrson T E,Roberts W D.Compatibility ofBeauveriabassianaisolates with insecticide formulations used in colorado potato beetle(Coleoptera:Chrysomelidae)control[J].Journal of Economic Entomology,1983,76:1437-1441.

[5] 潘洪祥,郑华.干早地区应用白僵菌防治松毛虫试验报告[A].见：中国植物学会虫生真菌专业组.中国虫生真菌研究与应用(第一卷)[M].北京：学术期刊出版社,1988:77-79.

[6] 李农昌,樊美珍,李春如.白僵菌有关培养条件及其与毒力关系的研究[J].安徽农业大学学报,1996,23(3):254-259.

[7] 唐晓庆,樊美珍,李增智.球孢白僵菌继代培养中菌落局变现象及环境影响因素的研究[J].真菌学报,1996,15(3):188-196.

[8] James R R.Effects of exogenous nutrients on conidial germination and virulence against the silver leaf whitefly for two hyphomycetes[J].Journal of Invertebrate Pathology,2001,77(2):99-107.

[9] 蔡国贵,林庆源,徐耀昌,等.白僵菌菌株退化与培养条件关系及其控制技术[J].福建林学院学报,2001,21(1):76-79.

[10]孔琼,袁盛勇,王传铭,等.营养成分对球孢白僵菌生长的影响[J].红河学院学报,2008,6(5):37.

[11]唐启义,冯明光.实用统计分析及其计算机处理平台[J].北京:科学出版社,2002:34-130.

[12]陆晴,曹伟平,董建臻,等.不同碳、氮营养对球孢白僵菌HFW-05的生长及胞外蛋白酶产量的影响[J].华北农学报,2008,23(5):142-146.

[13]Peczynska Czoch W,Urbanczyk M J.Production of beauvericin byBeauveriabassianaon L-methionine enriched medium[J].Archivum Immunologiae et Therapia Experimentalis,1991,39(1/2):181-184.

[14]邓春生,高松,高铁山,等.卵孢白僵菌营养需求及培养条件研究[J].中国生物防治,1996,12(4):165-167.

[15]杨珊珊.营养物质对白僵菌生育的影响[J].山西农业科学,1980(11):61.