久泻宁颗粒对大鼠溃疡性结肠炎细胞凋亡及其调控蛋白影响的研究

马少丹，阮时宝，苑述刚

(福建中医药大学药学院 方剂教研室，福建 福州 350108)

溃疡性结肠炎(UC)是一种以慢性非特异性肠道炎症为主要病变的疾病，临床主要表现为腹泻、腹痛、黏液血便等，多呈慢性反复发作过程[1]。现在UC的特异性致病因素及发病机制均不明确，大多数专家认为是多种因素相互作用的结果，如感染、遗传、免疫异常等。近年越来越多的研究[2-3]表明，细胞凋亡参与了溃疡性结肠炎的发病，且淋巴细胞的凋亡减慢和溃疡性结肠炎的发生关系密切。本实验观察了久泻宁颗粒对大鼠溃疡性结肠炎肠组织中淋巴细胞凋亡及其调控蛋白的影响，探讨久泻宁颗粒对溃疡性结肠炎肠黏膜的保护作用及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD大鼠40只，雌雄各半，体质量为(200±20)g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供；大耳白家兔4只，体质量2.0～2.5 kg，福建中医学院实验动物中心提供。

1.2 实验试剂 久泻宁颗粒(自备)，补脾益肠丸，批号:Z44023376，广州陈李济药厂生产。弗氏完全佐剂和2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)，(美国Sigma)。细胞凋亡检测试剂盒，兔IgG、Fas、Fas-L多克隆抗体及免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。仪器：OLYMPUSCX-40显微镜(日本奥林巴斯公司),LEICA Qwin图像软件分析系统(德国徕卡公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组 清洁级SD大鼠40只，随机分为4组，每组10只。各组分别为：正常组，UC模型对照组，补脾益肠丸治疗阳性对照组，久泻宁颗粒治疗组。

1.3.2 模型所需药物制备 异种异体抗原：参照许叔云[4]方法稍作改进，取家兔新鲜结肠黏膜组织，匀浆充分后，-20 ℃下冷冻24 h，溶冻后以4 000 r/min离心30 min,取上清液提纯，用总蛋白试剂盒双缩脲法测定蛋白质含量。抗原乳化液:异种异体抗原与弗氏完全佐剂等体积配比。灌肠液:2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)与无水乙醇等体积配比。

1.3.3 模型制作 除正常对照组外，其余各组大鼠在一侧足趾皮下注射抗原乳化液,使大鼠获得8 mg异种蛋白。14 d后，在大鼠腹股沟部位皮下注射抗原乳化液，同样使大鼠获得8 mg异种蛋白。至大鼠体内产生抗结肠抗体，禁食24 h后，将大鼠用乙醚麻醉，用硅胶管插入大鼠肛门深约8 cm，局部灌肠1 mL灌肠液。拔出硅胶管后迅速捏紧大鼠肛门8 min,其间不断摇摆大鼠，使液体在肠道均匀分布，待液体不再从肛门流出，把大鼠放回笼中常规饲养。

1.3.4 给药方法 正常组和UC模型对照组给等量的饮用水,久泻宁颗粒组以15 g/kg(相当于60 kg成人的等效剂量)，补脾益肠丸以2 g/kg(相当于60 kg成人的等效剂量)，每日1次，连续灌胃20 d。

1.3.5 标本采集及处理 大鼠灌胃第20天后，断头处死，取结肠溃疡明显处作病理分析。在结肠病变范围内剪取一块约0.5 cm×0.5 cm病变结肠，甲醛固定，石蜡包埋。一部分采用TUNEL染色方法测定细胞凋亡的情况；一部分采用免疫组织化学法检测Fas、Fas-L、蛋白的表达。

1.3.6 TUNEL染色方法测定细胞的凋亡 取石蜡切片，严格按照试剂盒说明书进行操作。以已知阳性切片作阳性对照，在染色过程中用PBS代替TdT反应液作阴性对照，BC1P/NBT显色，凋亡细胞其细胞核染色为蓝黑色。每张切片随机选取2个视野,分别计数凋亡细胞数和结肠细胞总数，以凋亡细胞数占细胞总数的百分比作为凋亡指数(AI)。

1.3.7 免疫组织化学法检测Fas、Fas-L蛋白的表达 石蜡切片脱蜡，抗原微波修复，分别滴加兔Fas、Fas-L蛋白的表达多克隆抗体,按免疫组织化学法试剂盒说明书操作，采用LEICA Qwin图像软件分析系统进行分析，以细胞质染成棕黄色为阳性细胞。每张切片黏膜和黏膜下层随机选取2个视野，取阳性细胞积分光密度的均数表示该样本IOD值,LEICA数字显微照相机采集图像计算总阳性细胞数。

2 实验结果

2.1 大鼠结肠组织的改变 在灌肠3 d后，各造模组大鼠大部分出现稀便，甚至稀水、脓血，肛门周围潮湿、污秽,精神萎靡，瘦弱拱背。3周后模型组大部分大鼠依然可见稀便或黏液便、精神萎靡等症状。病理分析示：肉眼可见结肠肠壁增厚，管腔变粗，黏膜脱落，溃疡明显；腺体及肠壁各层可见大量急、慢性炎细胞。镜下可见血管增生、炎性肉芽肿及淋巴滤胞结构。补脾益肠丸组大鼠大部分无腹泻或腹泻轻微。病理分析示：可见腺体结构出现，一层上皮组织盖住溃疡。结肠肉眼观黏膜水肿较轻，溃疡和炎性渗出物较少见；镜下结肠结构基本正常。久泻宁颗粒组大鼠大部分无腹泻或腹泻轻微。病理分析示：上皮组织基本完整，腺体排列较规则，溃疡基本愈合。正常对照组：大鼠结肠黏膜上皮完整，连续，腺体排列规则，结构清楚。

2.2 TUNEL染色结果 TUNEL阳性表达为细胞核着色为棕褐色。正常大肠组织仅可见肠黏膜有散在阳性表达，量很少。模型组大鼠肠黏膜阳性细胞数目较多，核染颜色较深。久泻宁颗粒组和补脾益肠丸组阳性细胞的数目较模型组显著减少。

2.3 各组Fas和Fas-L蛋白的表达 见表1。

表1 各组Fas和Fas-L蛋白的表达(±s)

3 讨论

细胞凋亡是指在某些生理或病理因素诱导下，激活膜信号系统，启动自身内部机制，主要通过内源性DNA内切酶的激活而发生的自然死亡现象[5]。凋亡对生命的正常发育、生长及维持内环境稳定都有着重要的作用。细胞凋亡是由参与细胞凋亡的系列基因相对表达程度决定的，并受多种细胞因子的影响。其中Fas/Fas-L为细胞凋亡发生的重要途径。UC发病时Fas/Fas-L表达均显著升高，说明细胞凋亡是UC发生的重要因素，实验结果亦证实了此种理论。

久泻宁颗粒由淮山药、野麻草、白芍、荷叶、防风、砂仁、甘草等药物组成。淮山药补脾养胃，生津益肺，补肾涩精，善治脾虚泄泻；野麻草清热利湿，消肿解毒为有效的止痢药、止血药；2药配伍共为君药。白芍平肝止痛，养血调经，敛阴止汗；荷叶清热解暑,升发清阳，凉血止血；2药共为臣药，与君药配伍,可增强本方健脾渗湿之功。防风、砂仁均为方中佐药。防风可发表散风，胜湿止痛，止痉、止泻；砂仁可化湿开胃，温脾止泻，理气安胎；防风与白芍配伍取痛泻要方之义以补脾土而柔肝木，配伍砂仁则温脾理气以缓痛泻。甘草可补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药，为使药。全方配伍以健脾渗湿，调气止泻为法，标本兼治，不寒不燥，实为治疗慢性泄泻之良方。本实验表明，久泻宁颗粒可能是通过调节结肠黏膜层淋巴细胞中Fas、Fas-L表达而影响结肠黏膜固有层淋巴细胞凋亡，达到缓解UC的目的。

[1]WilksS.Them orida ppearance ofthein testineo fmissb anks[J].MedicalTu nesand Gazete,1859(2):264.

[2]白文生,任秀萍.细胞凋亡在组织损伤中的作用及意义[J].临床荟萃,2002,17(23):1419-1421.

[3]Ueyama H,Kiyohara T,Sawada N，et al.High fas ligand expressionon lymphocytes in lesions of ulcerative colitis[J].Gut,1998,43(1):48-55.

[4]许叔云.药理实验方法学[M].3版.北京:人民卫生出版社,2002:1335-1336.

[5]王红伟,徐华明.针刺对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑细胞凋亡的影响[J].河南中医学院学报,2007,27(6):21-22.