ZPSJ复方对ICV-STZ模型大鼠海马组织蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的影响

第五永长，李耀辉，苏露煜

(1.陕西中医学院中医临床医学院，陕西 咸阳 712046；2.陕西省中医医院，陕西 西安 710061)

脑组织蛋白激酶与蛋白磷酸酯酶之间的平衡失调是导致tau蛋白过度磷酸化从而形成阿尔茨海默病(AD)病理改变细胞内神经元缠结(NFT)的重要途径之一,本实验以侧脑室注射链脲佐菌素(ICV-STZ)的方法复制散发性老年性痴呆(SAD)模型,以燥湿解毒，助脾散精之中药复方ZPSJ提取物进行干预,观察ZPSJ复方对SAD模型大鼠海马组织重要的蛋白激酶糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)和蛋白磷酸酯酶-2(PP-2A)的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 SPF级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠28只，体质量(270±20)g，由第四军医大学实验动物中心提供(实验动物合格证号:0034642)。所有大鼠随机分为假手术组、模型组、多奈哌齐组、ZPSJ治疗组，均饲养于屏障环境实验动物室(使用许可证:SYXK【陕】2007-2010)。实验过程中动物自由摄食和饮水(术前禁食除外),室温22～26 ℃，湿度为30%～40%。

1.2 药品与试剂 ZPSJ方：由人参、苍术、黄连等药物组成，提取物由陕西中医学院附属医院制剂中心提供；链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)：Merck公司；GSK-3β抗体、PP-2A抗体：武汉博士德生物工程公司；多奈哌齐：由中美合资西安海欣制药有限公司生产，药物购自第四军医大学西京医院药房(产品批号：091201)。

1.3 ICV-STZ拟AD模型制备 参考Sharma等[1]的方法，所有大鼠经10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉后，固定于江湾Ⅰ型C大鼠立体定位仪上，常规消毒皮肤，正中矢状切口，分离骨膜，锥颅器钻开颅骨，暴露硬脑膜。除假手术组外，其余动物均用微量注射器每侧侧脑室各注射STZ约18 μL(3 mg/kg，注射前将STZ溶于人工脑脊液,浓度为25 mg/mL)。坐标参考包新民《大鼠脑立体定向图谱》[2]：前囟后1.5 mm，矢状缝左右旁开1.5 mm，脑表面下3.5 mm。第3天重复注射，剂量同前。假手术组以等量人工脑脊液替代STZ。术后常规饲养21 d进行行为学测试后取材。

1.4 脑组织样品处理 每组随机选取6只大鼠进行灌注固定：按4.0 mL/kg的剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠。动物麻醉成功后，将其仰卧于平台上，伸展固定四肢，剪开胸腹充分暴露心脏和肝脏。迅速插导管于左心室至升主动脉并固定，同时剪开右心耳。快速灌注生理盐水100 mL至肝脏完全变白，右心室流出澄清液体后，更换4%多聚甲醛先快后慢继续灌注30 min，然后断头，完整取出鼠脑，置固定液中，24 h后行石蜡包埋切片。每只大鼠海马CA1区出现后连续冠状切片，放入0.01M PBST的溶液中进行免疫组化染色。

2 结果

2.1 GSK-3β免疫组织化学染色结果 见表1。

表1 各组大鼠海马CA1区GSK-3β的表达情况(±s,n=6)

2.2 PP-2A免疫组织化学染色结果 见表2。

表2 各组大鼠海马CA1区PP-2A的表达情况(±s,n=6)

3 讨论

目前公认,AD的病理特征主要为大脑局部尤其是海马和皮层神经元退行性病变,细胞内神经原纤维缠结(NFT)和细胞外老年斑(SP)沉积。决定AD认知损害症状的关键在于细胞内NFT的形成，而脑组织tau蛋白过度磷酸化是NFT的形成的源头。在脑内,tau蛋白磷酸化受到多种因素的调节,其中蛋白激酶与蛋白磷酸酯酶之间的平衡失调是导致tau蛋白过度磷酸化的重要途径[3]。

近年研究认为，糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是AD脑内引起tau蛋白异常过磷酸化的最主要蛋白激酶，对tau蛋白的磷酸化起着非常重要的催化作用。而与此过程相反,蛋白磷酸酯酶催化着tau蛋白的去磷酸化反应，tau蛋白的过度磷酸化可由于蛋白磷酸酯酶活性降低或数量减少而引起。其中，最引人注目的当属蛋白磷酸酯酶-2中的PP-2A,PP-2A活性的降低可能是导致AD脑内tau蛋白以及其他蛋白过度磷酸化的主要原因。

近年来，tau蛋白磷酸化作为AD防治的新靶标越来越得到重视，其中中草药在抑制tau蛋白磷酸化防治AD病理改变方面显示了令人鼓舞的作用。如人参中Rb1可以通过CDK5以及JNK/p38途径减轻Aβ25-35诱导的tau蛋白过度磷酸化[4]等;知母皂苷B也可通过缓解Aβ对信号转导通路的抑制，减轻tau蛋白的异常磷酸化[5]。从中药吴茱萸未成熟果实中提取的去氢吴茱萸碱(DHED)可通过抑制GSK-3β活性从而降低tau蛋白的磷酸化[6]。

本实验从“脾脑相关”的理论出发，以具有燥湿解毒，助脾散精作用的中药复方ZPSJ提取物为干预药物，采用ICV-STZ拟SAD模型进行观察，结果表明:ICV-STZ模型大鼠脑组织GSK-3β阳性表达的神经元明显增多，而PP-2A阳性表达的神经元明显减少，经过ZPSJ复方治疗后，大鼠脑组织GSK-3β表达明显减少,PP-2A表达明显增加,与之相对照的西药多奈哌齐则无此作用。本结果提示: ZPSJ复方可能通过调节脑组织GSK-3β和PP-2A的表达及其平衡而影响到tau蛋白的异常过度磷酸化,推测上述结果可能是复方中多种成分的协同作用。有关该方潜在的影响tau过度磷酸化防治SAD认知损害的深层次机制，有必要进一步深入研究。

[1]Tauheed Ishrat,Kehkashan Parveen,Mohd.Moshahid Khan,Gulrana Khuwaja,M.Badruzza-man Khan,Seema Yousuf,Ajmal Ahmad,Pallavi Shrivastav and Fakhrul Islam.Selenium pre-vents cognitive decline and oxidative damage in rat model of streptozotocin-induced experim-ental dementia of Alzheimer’s type[J].Brain Research,2009(1281):117-127.

[2]George Paxinos Charles Waston著,诸葛启钏译.The Rat Brain in stereotaxic coordinates(大鼠脑立体定向图谱)[M].3版.北京:人民卫生出版社,2005.

[3]Patrice Delobel,Isabelle Lavenir,Graham Fraser,et al.Analysis of Tau Phosphorylation and Truncation in a Mouse Model of Human Tauopathy Analysis of Mouse Tauopathy[J].AJP January 2008,172,123-131.

[4]宋锦秋,陈晓春,张静,等.人参皂苷Rb1通过JNK-p38 MAPK途径减轻Aβ25-35诱导的胎鼠皮层神经元tau蛋白过度磷酸化[J].药学学报.2008,43:29-34.

[5]钟雷,谭洁,欧阳石,等.知母皂苷B对大鼠海马注射Aβ25～35致tau蛋白磷酸化的影响[J].南方医科大学学报,2006,26(8):1106-1109.

[6]Peng JH,Zhang CE,Wei W,Hong XP,Pan XP,Wang JZ.Dehydroevodiamine attenuates tau hyperphosphorylation and spatial memory deficit induced by activation of glycogen synthase kinase-3 in rats[J].Neuropharmacology.2007;52:1521-1527.