RAEBT型骨髓增生异常综合征患者白血病相关融合基因分析（附病例报告）

吴强强，王冬青，郝红峰，岳 青，王桂臣，孙黎飞

骨髓增生异常综合征 （myelodysplastic syndrome，MDS）是一组由于造血干细胞异质性克隆导致的疾病。MDS临床表现较为复杂，通常表现为外周血一系至三系降低，骨髓增生异常，并伴有造血细胞病态造血，其最终发展结局并不一致，其中约30%～60%的患者经过数月或数年后可以转变为白血病。按照不同病程情况MDS分为不同型别，笔者所在医院血液肿瘤科收治了1例MDS-RAEBT患者，为了进一步观察和监测患者的病情发展情况，笔者检测并分析了其骨髓细胞中白血病相关融合基因的表达情况。

1 对象和方法

1.1 病例资料 患者，男，51岁，因原因不明发热入院。体格检查：体温37.3°C，脉搏110次/min，呼吸18次/min，血压115/75 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。 血液分析：WBC 4.7×109/L，Hb 67 g/L，HCT 0.19%，MCV1 00 fL，PLT 44×109/L。为查明贫血原因行骨髓检查，细胞学结果显示增生极度活跃伴原始粒系和淋巴细胞过多，初步诊断为MDS-RAEBT粒淋混合细胞型，转入血液科继续进行治疗。

1.2 材料和试剂 检测材料为患者骨髓穿刺时取得的骨髓标本。主要检测试剂包括RNA提取试剂盒和反转录试剂盒（天根生物技术公司），白血病融合基因检测试剂盒（思尔成生物技术公司）等。

1.3 骨髓细胞学分析 抽出患者骨髓及时制备涂片标本，标本经瑞氏-吉氏染色，镜检观察并分析骨髓细胞特征。另选骨髓涂片做过氧化酶POX染色，通过镜检观察细胞质中过氧化酶的表达情况分析骨髓细胞类型。

1.4 白血病相关融合基因的检测 为确定患者骨髓中可能存在的分子遗传学变异情况，笔者应用多重巢式逆转录PCR方法检测了目前已知的融合基因的表达情况。

1.4.1 骨髓细胞mRNA的提取与反转录 RNA的提取步骤按照试剂盒标准步骤进行，将患者骨髓标本，置于红细胞裂解液中裂解红细胞，离心除去上清，得到的白细胞沉淀用细胞裂解液裂解、过滤柱过滤后收集滤液，DEPC乙醇沉淀RNA，吸附柱吸附RAN沉淀，经过去蛋白、脱DNA等纯化步骤后，得到骨髓细胞 RNA。取 10ulRNA经逆转录后得cDNA，以cDNA为模板扩增并电泳检测白血病相关融合基因的表达情况，包括AML1-ETO、BCR-ABL、CBF-MYH、E2A-PBX、MLL-AF4、PML-RARα、SIL-TAL、TEL-AML等8类白血病相关基因及其41种亚型。

1.4.2 多重巢式PCR检测融合基因 以逆转录得到的cDNA为模板，按照标准步骤进行扩增检测融合基因。第一轮反应条件为：95℃ 5min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 2min，共30个循环；4℃保存。第二轮反应条件为：95℃ 5 min；95℃30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，共30个循环；72℃ 5 min产物充分延伸；4℃保存。取扩增产物10 μl上样，2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外检测仪检测结果。

2 结 果

2.1 患者的骨髓细胞学特征 结合外周血片显微镜分析患者骨髓细胞特征，结果显示骨髓增生极度活跃，并且伴原始幼稚粒系和幼稚淋巴细胞过多，血小板少见，可诊断为MDS-RAEBT粒淋混合细胞型，图1示骨髓涂片中的幼稚粒系与幼稚淋巴细胞，分别可占片中骨髓细胞总数的26%与24%。

图1 患者骨髓细胞涂片（10×100）

POX染色结果显示幼淋巴细胞呈阴性表达，粒系细胞呈现强阳性表达，细胞胞浆中充满粗大的蓝黑色颗粒（图2）。

图2 过氧化物酶染色（10×40）

对骨髓中白血病融合基因的检测结果发现在AML1-ETO泳道有荧光信号，提示患者骨髓细胞中染色体断裂形成的AML-ETO易位基因呈阳性，图3箭头所示，图3示从左向右的融合基因依次为TEL-AML、SIL-TAL、PML-RARα、MLL-AF4、E2A-PBX、CBF-MYH、AML1-ETO和BCR-ABL。

图3 融合基因的RT-PCR检测电泳图

3 讨 论

MDS的确切病因及其分子机制尚不明确，其诱因多样，生物、化学或物理等因素均可引起染色体异常导致基因突变，从而使某个恶变的细胞克隆性增生，也可能只引起基因表达的改变导致MDS。由于MDS临床表现较为复杂，而其向白血病转化的过程中分子遗传学改变的机制可能更为复杂。

研究发现在不同类型的白血病中存在不同的分子标记物。在急性髓细胞白血病（AML）中存在特异性遗传标志为8号与21号染色体的长臂在二区二带断裂并相互易位 [t（8；21）（q22；q22）]，AML1基因重排可作为诊断AML的分子标志[1,2]。t（8；21）（q22；q22）使21号染色体上的AML1基因与8号染色体上的ETO基因发生融合，形成AML1-ETO融合基因，产生一种嵌合蛋白，作为主要的抑制物改变了正常AML1-CBF（核结合因子）β这种与造血干细胞分化有关的转录复合物的生理功能[3,4]，同时在AML中还发现原始细胞CD34抗原表达率及表达强度均高于正常的原始细胞[5]。此外研究还显示，AML1-ETO易位基因见于10%的原发性AML，在M2型中的阳性率可达50%，其中M2b中甚至达到90%。AML1-ETO阳性的细胞有一定程度的分化能力，并且对化疗反应较为敏感，大剂量阿糖胞苷治疗效果较好，具有较高的缓解率，预后较好，无病生存期长[3]。

国内有学者研究分析了AML1-ETO阳性病例骨髓涂片,检测到骨髓涂片中的异形中幼粒细胞与AML1-ETO基因阳性表达存在关联[6]。也有学者发现儿童AML患者AML1-ETO融合基因阳性不能提示形态学是否可诊断为M2b，AML1-ETO融合基因对儿童M2b没有成人特异[7]。新近的研究还发现AML1-ETO融合基因与白血病TSC基因的转录激活有关[8]。

关于MDS和白血病关系，已有的研究提示部分MDS最终可能会恶性转化为白血病。本文患者骨髓细胞分析显示MDS-RAEBT粒淋混合细胞型，但是却表现为AML-ETO融合基因阳性。由于染色体易位导致的AML-ETO融合基因目前认为是AML的分子标记物，这提示了在MDS的转化过程中已经发生染色体易位，导致了基因组不稳定并产生异质性细胞，提示可能在MDS向白血病转化的过程中，骨髓细胞由于某些因素作用使得染色体发生断裂与重接，原来染色体上的正常功能基因发生改变，产生基因突变，形成了新的融合基因，而携带该突变基因的骨髓细胞克隆产生不正确的效应分子，与后期的白血病发生密切相关，并使得发生白血病转化的可能性大大增加。

对于AML型白血病，尽管存在局限性，但AML1-ETO融合基因仍然是目前发现的可靠的检测标记物，AML1-ETO融合基因在正常人体细胞中不存在，因而也可以作为白血病微小残留病检测的基础。虽然目前对于MDS以及白血病的研究已经取得了较大的进展，但是对于MDS与白血病的进展关系、分子水平的发病机制以及高效可靠的分子诊断标记物的研究仍然需要更多的实验证据。越来越多的研究证实现阶段在临床检验中，对于MDS患者进行融合基因的筛查对于指导疾病的诊断、治疗和预后具有重要的意义[9,10]。

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