多波长高效液相色谱法同时测定抗菌消炎胶囊中3种有效成分的含量

黄 铭 黄冬梅 彭莉云

1.广西壮族自治区柳州食品药品检验所，广西 柳州 545001;2.广西中医学院赛恩斯新医药学院，广西 南宁 530001

抗菌消炎胶囊为收载于部颁药品标准第七册［1］的抗菌消炎片改变剂型品种，由金银花、百部、黄芩、大黄、大青叶、知母、金钱草等7味中药组成，具有清热、泻火、解毒的功效。

原片剂标准未对组方中任何有效成分进行定性、定量监控，在《中国药典》(2010年版)中并未收入有关抗菌消炎胶囊含量测定的方法和标准。方中金银花清热解毒，凉散风热，其有效成分为绿原酸;黄芩清热燥湿、泻火解毒、止血，其有效成分为黄芩苷、黄芩素;大黄泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、活血祛瘀，其有效成分为大黄酚、大黄素、大黄酸等。该制剂已有一些文献对抗菌消炎片的药效学、薄层色谱、某些成分含量测定方面作了研究报道［2－10］。本实验采用多波长高效液相色谱 (HPLC)法同时测定抗菌消炎片中绿原酸、黄芩苷和大黄酚的含量，以控制本品的内在质量。

1 仪器和试药

1.1 仪器 Agilent LC－1100高效液相色谱仪，包括四元泵、自动进样器、1260二极管阵列检测器。色谱柱为VPODS C18柱 (4.6mm×250mm，5μm)，岛津AE200电子分析天平。

1.2 试药 对照品绿原酸 (0753－200111)、黄芩苷(110715－200514)和大黄酚 (0796－200005)均购自中国药品生物制品检定所。甲醇为色谱纯、磷酸为分析纯，水为一级纯化水。

抗菌消炎胶囊为广西柳州某药厂提供，阴性样品按抗菌消炎胶囊处方比例配置。

2 方法和结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取对照品绿原酸、黄芩苷和大黄酚适量，精密称定，置同一20ml量瓶，用70%甲醇溶解并定容，摇匀，即得混合对照品备用溶液。精密吸取上述混合对照品备用溶液，稀释成浓度分别为绿原酸10.58μg/ml、 21.16μg/ml、 42.32μg/ml、 105.8μg/ml 、211.6μg/ml 、 317.4μg/ml ; 黄 芩 苷 15.77μg/ml、31.54μg/ml、 63.08μg/ml、 157.7μg/ml、 315.4μg/ml、473.1μg/ml;大黄酚 0.5043μg/ml、1.009μg/ml、2.017μg/ml、5.043μg/ml、10.09μg/ml、15.13μg/ml的混合对照品溶液，摇匀，即得。

2.2 供试品溶液的制备 取抗菌消炎片20片，去除包衣用研钵碾成细粉，精密称取上述粉末0.30g，置50ml具塞锥形瓶中，称定重量，加70%甲醇20ml超声处理30min，静置至室温，用70%甲醇补足减失的重量，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 色谱条件 色谱柱:VP－ODS C18柱 (4.6mm×250mm，5μm);流动相:A相为0.1%磷酸水溶液，B相为甲醇，梯度洗脱 (0～20min:85% →55%A，15% →45%B;20～40min:55%A，45%B;41～42min:55%→85%A，45%→15%A);流速:1.0ml/min;检测波长:280nm(0～20mim，检测绿原酸)、372nm(20～30nim，检测黄芩苷)、254nm(30～40nim，检测黄芩苷);柱温:30℃;进样量为 10μl。

2.4 系统适应性 阴性样品在绿原酸、黄芩苷和大黄酚的色谱峰位置上无吸收，表明该方法的专属性良好，且在40min内基线分离且空白无干扰。空白、对照品以及样品的色谱图见图1。

2.5 线性关系考察 分别将配置的系列对照品溶液依次进样，以对照品溶液的浓度 (X，μg/ml)对峰面积 (Y)进行线性回归。绿原酸、黄芩苷和大黄酚的回归方程分别为:Y=10.35X－5.354，r=0.9999;Y=9.753X－1.768，r=0.9988;Y=13.43X－2.876，r=0.9996。线性范围:绿原酸10.58 ～317.4μg/ml，黄芩苷15.77 ～473.1μg/ml，大黄酚0.5043 ～15.13μg/ml。

2.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液10μl，重复进样5次，测定峰面积RSD(n=5)结果分别为:绿原酸0.65%，黄芩苷0.48%，大黄酚0.77%。表明该方法的精密度良好。

2.7 检测限 将绿原酸、黄芩苷、大黄酚对照品溶液分别进行稀释，以信噪比为3∶1时，确定其最低检测限分别为0.321μg/ml、0.210μg/ml、0.044μg/ml。

2.8 稳定性试验 取制备的供试品溶液，分别在0、1、2、4、8、16、24h测定绿原酸、黄芩苷、大黄酚的峰面积，计算峰面积的RSD分别为1.0%、1.3%、1.9%，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.9 重复性试验 精密称取同一批供试品5份，分别按供试品测试条件测定绿原酸、黄芩苷、大黄酚的峰面积，计算峰面积的RSD为0.73%;黄芩苷RSD为0.87%;大黄酚RSD为1.80%;结果表明本方法的重复性良好。

2.10 加样回收率试验 精密称取同一批已知含量的供试品0.15g共9份，按低、中、高浓度分别精密加入绿原酸、黄芩苷、大黄酚对照品溶液一定的量 (样品含量的80%、100%、120%)，每一浓度平行制备3份，照供试品测定项下操作，测定峰面积，计算回收率，结果绿原酸、黄芩苷、大黄酚的回收率分别为:99.5%(RSD=0.8%，n=3);98.9%(RSD=1.1%，n=3);98.3%(RSD=1.8%，n=3)。结果表明，采用本方法测定抗菌消炎胶囊中绿原酸、黄芩苷、大黄酚的含量，加样回收率良好。

2.11 样品测定 照供试品测定项下操作制备供试品溶液3份，测定峰面积，将所得的峰面积代入标准曲线，计算绿原酸、黄芩苷、大黄酚的平均含量，分别为8.30mg/g(RSD=0.45%)、20.33mg/g(RSD=0.78%)、0.11mg/g(RSD=1.9%)。

3 讨论

3.1 检测波长的选择取对照品溶液，在200nm～400nm波长范围内进行紫外光谱扫描，结果在280nm波长处黄芩苷有最大吸收，372nm波长处绿原酸有最大吸收，254nm波长处大黄酚有最大吸收。在实验中曾选择280nm波长下同时检测3个成分，结果发现降低了绿原酸和大黄酚的检测灵敏度。故采用多波长分别在各个被测成分紫外最大吸收波长处同时进行含量检测。即提高了检测灵敏度，又保障测定结果准确可靠。

3.2 样品前处理方法的选择 在采用相同溶剂的条件下，超声提取效率和回流提取效率相当，由于回流法过程烦琐，易造成损失而且绿原酸受热不稳定不宜热提［7］，且考虑到超声提取操作步骤简便，于是选用超声法。溶剂种类考察了甲醇、70%甲醇、50%甲醇;溶剂体积考察了15、20、30ml;超声时间考察了15、30、45min。结果以20ml、70%甲醇提取30min效果较好。所以样品采用70%甲醇20ml超声提取30min作为前处理条件。

3.3 液相条件的选择

3.2.1 流动相的选择 本实验尝试了0.1%磷酸水溶液－甲醇、0.2%磷酸水溶液－甲醇、0.1%磷酸水溶液－乙腈等多种流动相系统。经过试验，发现以甲醇－0.1%磷酸水溶液作为流动相体系，不仅3种成分的峰型良好且与杂质峰的分离度均能达到要求，故最终选用0.1%磷酸水溶液－甲醇作为流动相。

3.3.2 洗脱条件的摸索 选择合适的洗脱条件对样品的有效分离起着关键的作用。本制剂为中成药，成分较复杂，且3种成分极性差异大，采用等度洗脱难以达到分离效果。通过考察不同梯度配比的流动相，最终确定本方法采用的梯度洗脱的方法，可将被测成分与其他杂质峰有效分离，色谱基线平稳，分离度、拖尾因子等色谱参数都能达到要求。

［1］中华人民共和国卫生部药品标准［S］.中药成方制剂.第七册，1993:75.

［2］黄俊.抗菌消炎片的抗菌抗炎实验研究［J］.广西中医学院学报，2001，7(1):39－42.

［3］赵小霞，张丁丁.抗菌消炎片的薄层研究［J］.中医药信息，2002，19(4):68－70.

［4］潘馨.高效液相色谱法测定银黄胶囊中绿原酸及黄芩苷的含量［J］.中国现代应用药学，2003，20:493－495.

［5］马骏，陈凌，任远，王志旺，吴国泰.抗菌消炎片主要药效学研究［J］.中成药，2005，06:22.

［6］车庆明，薛彬彬，陈颖.高效液相色谱法测定双黄连制剂中黄芩苷和黄芩素的含量［J］.中国医院药学杂志，2007，27:211－213.

［7］史克莉，许蜡英.不同提取方法对金银花中绿原酸含量测定的影响［J］.中医药学刊，2007，25:820－821.

［8］抗菌消炎片中绿原酸的含量测定［J］.安徽医药，2008，12(9):797－798.

［9］高效液相色谱法测定抗菌消炎片绿原酸、黄芩苷、黄芩素和大黄酚的含量［J］.第二军医大学学报，2009，30(10):1191－1194.

［10］HLPC法测定抗菌消炎片中黄芩苷的含量［J］.齐鲁药事，2010，29:08.