中药独活中总香豆素高通量分析方法的建立

2011-04-17郭新荣张秋红常艳旭

中国民族民间医药 2011年9期

李晋郭新荣张秋红常艳旭

天津市现代中药重点实验室天津中医药大学，天津 300193

独活为伞形科植物重齿毛当归［Ange1ica pubescens Maxim f biserrata Shan et Yuan］的根，是一种常见的中药，具有祛风除湿，通痹止痛之功效，用于风寒湿痹，腰膝疼痛，少阴伏风头痛，风寒协湿头痛［1］。现代研究表明，独活含有数十种香豆素类化合物，如东莨菪内脂、伞形花内脂、二氢山芹醇、补骨脂素、二氢欧山芹醇乙酸酯，蛇床子素、异欧前胡素二氢欧山芹素等，其中蛇床子素含量最高［1］。

目前，独活总香豆素含量测定方法主要以采用紫外分光光度法为主［2－3］，但该种方法由于每次仅能1－3个样品，具有低通量的特点，不适合大量的样品检测。因此，本试验以蛇床子素为对照品，用多功能读板机，拟建立一种高通量的独活中总香豆素含量测定方法，为独活药材及饮片控制提供一种简单、快速、高通量的分析方法。

1 仪器与试药

AX－105十万分之一天平;BP121S万分之一天平 (德国赛多利斯);SB－1000YDTD超声清洗槽 (宁波新芝科技股份有限公司，40KHZ);微量多功能读板机 (infinite M200);96孔板 (Cos96ft－Corning 96 F1at Transparent)。

蛇床子素对照品 (成都曼斯特生物科技有限公司)，甲醇 (色谱纯)，无水乙醇 (分析纯)，纯水，不同产地独活饮片购买于药材各地药材市场，经作者鉴定为伞形科独活。分别粉碎，过100目筛，密封保存，备用。

2 实验方法

2.1 对照品溶液的制备

精密称取减压干燥至恒重的蛇床子素对照品2 mg，置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成400 μg/mL的蛇床子素标准液。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取独活药材粉末0.125 g，置10 mL具塞试管中，加60%甲醇定容至10 mL，超声40 min，称定重量，声提取40min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3 结果

3.1 测定波长的选择

分别精确量取对照品溶液及供试品溶液各0.2 mL，置于10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀，在波长为200～400 nm范围内扫描，对照品溶液和供试品溶液均在315～325 nm范围内有明显吸收，吸收峰在320 nm附近，故选择320 nm作为测定波长。

3.2 方法学验证

3.2.1 标准曲线

精密吸取一定量蛇床子素标准液置10m1容量瓶中，加入甲醇稀释得到3、6、12、18、24、30、36、42、48、54、60 μg/m1溶液。以甲醇为空白对照，绘制标准曲线:y=0.0331x－0.0089(r=0.9995)。结果表明蛇床子素质量浓度在3～60ug/m1范围内，呈良好的线性。

3.2.2 精密度

精密吸取8μg/m1对照品溶液200 μ1，加入到96孔板中，320nm波长下测定吸光度，重复测6次，吸光度值RSD 为0.27%。

3.2.3 重复性

取同一批药材6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，测定总香豆素的含量为2.17%，RSD为1.83%，表明该方法重复性好。

3.2.4 稳定性试验

取供试品溶液0.2 mL，按标准曲线制作方法，分别在1，2，6，8，12，16，24 h测定吸光度，考察样品24 h稳定性。经计算，RSD=0.87%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

3.2.5 加样回收率试验

精密称取已知含量的独活样品粉末约0.05g，共6份，置10 mL具塞试管中，分别加入质量为1086 μg的标准品，按供试品溶液制备方法，制备含对照品的样本溶液6份，测定并计算，结果见表1，平均回收率为98.9%，RSD为 3.00%。

表1 加样回收实验结果

3.3 样品测定

精密称取不同来源独活饮片粉末，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液0.2 mL，按标准曲线制作方法测定其吸光度。利用回归方程求出供试品溶液中折合蛇床子素的浓度 (总香豆素)，并计算独活中总香豆素的含量，结果见表2。

4 讨论

本研究以蛇床子素为对照品，利用多功能读板机，建立了可同时测定96个独活样品中总香豆素高通量含量测定分析方法，并对不同产地的独活饮片进行了总香豆素的含量测定，结果表明该方法简便、准确，适用于中药独活药材中总香豆素含量测定。同时发现不同地区即使相同产地的独活饮片质量存在很大差异;不同批次的独活样品中总香豆素的质量分数在0.95～3.39%，均值2.69%。该研究结果表明了所建的高通量的分析方法简单，稳定可靠，重复性好，可用于独活的质量控制，为独活质量标准的制定提供参考。