荔枝核提取液抗小鼠体内FM1流感病毒的作用

李 伟 朱宇同 黄真炎 何家靖 裴 晶 宋健平

广州中医药大学，广东 广州 510405

荔枝核为无患子科植物荔枝 (Litchi chinensis Sonn.)的干燥成熟种子，主产于我国广东、广西、福建、四川和台湾等地区［1］。又名荔仁、荔核、大荔核。其味甘、涩、微苦，性温，归肝、肾经。具有行气散结、祛寒止痛的作用。近年来有文献报道荔枝核有抗乙肝病毒、保肝、降血糖、调血脂、抗氧化等作用［2］。水提取物及黄酮类化合物体外实验证明对乙型肝炎病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒有明显的抑制作用［3－6］。但目前笔者尚未见国内外有荔枝核提取液在体内抗流感病毒作用的相关报道。本实验研究荔枝核黄酮类提取液体内抗鼠肺适应株FM1甲1型流感病毒的作用，并对其进行了初步探讨。

1 材料

1.1 动物 NIH小鼠，雌雄各半，体重14－16 g，SPF级，由广东省医学实验动物中心提供，动物质量许可证号:SCXK(粤)2008－0002。饲养环境:室温为23±2℃，相对湿度为75±10%，用标准鼠料及水饲养。

1.2 毒种 甲1型H1N1流感病毒FM1鼠肺适应株，由中国药品生物制品检定所提供，经鸡胚尿囊腔传代增强毒力后，测定其半数致死量LD50=10－3.7。

1.3 药物 荔枝核提取液，由广州中医药大学青蒿中心药学研究室提取配制。利巴韦林 (Ribavirin)，广东肇庆星湖生物化学制药厂，批号:L051075。

2 方法

2.1 半数致死量的测定 病毒经过11日龄鸡胚传代1次，测定尿囊液中病毒效价为1:160，以10倍递减稀释成10－1，10－2，10－3，10－4，10－5，10－6，分别滴 0.05mL 感染小鼠，每组5只，逐日观察记录动物死亡数，24h内死亡者不计;直至感染后14d为止，死亡小鼠解剖观察肺脏病理变化，以确定其死亡由于流感病毒感染所致。用Reed－Muench 法［7］计算其 LD50 为 10－4.5。

2.2 荔枝核提取液对流感病毒所致小鼠死亡的保护作用

取NIH小鼠80只，体重14～16g，雌雄各半，随机分为5组，每组16只。第1组为正常对照组、第2组为病毒对照组，第3组为利巴韦林阳性药物组，第4～5组分别为荔枝核高、低2个剂量组。各组动物于感染前一天开始灌胃给药，每天1次，给药10d，利巴韦林组给予药物0.075g/kg，荔枝核高、低剂量组分别按照剂量为0.3g生药/kg，0.1g生药/kg给药，正常对照组和病毒对照组分别灌胃等体积蒸馏水。于给药第2d，将小鼠 (第1组除外)在乙醚轻度麻醉下接种8LD50的流感病毒0.05mL/只。连续观察14d，记录小鼠死亡数 (接种病24h内死亡的小鼠不记入死亡数中)，为死亡者于第15d处死解剖，计算死亡率、死亡保护率、生命延长率，平均存活时间。

2.3 对小鼠流感病毒肺炎的抑制作用 将小鼠按体重随机分为正常对照组、病毒对照组、利巴韦林组、荔枝核高、低剂量组，共5组，每组10只，雌雄各半。利巴韦林组，荔枝核高低剂量组，给予相应剂量药物，分别为0.075g/kg、0.3g/kg、0.1g/kg，正常对照组、病毒对照组给予等体积蒸馏水，除正常对照组外，其它各组小鼠在乙醚轻度麻醉下，以15LD50病毒液滴鼻感染，每鼠0.05mL。于感染前一天开始灌胃给药，每天1次，每次0.1 mL/10g，连续5 d。于第6 d禁食4 h，小鼠称重，颈椎脱臼处死，解剖取肺脏，用生理盐水洗净，并用干净滤纸吸掉残余盐水，称重，计算肺指数及肺指数抑制率。

2.4 荔枝核提取液对小鼠肺炎治疗作用的光镜观察 取2.3中各组别小鼠肺组织，10%甲醛固定，石蜡包埋，5μm切片进行常规HE染色，光镜下观察。

2.5 荔枝核提取液对小鼠肺炎治疗的透射电镜法观察 取2.3中各组别小鼠肺组织，立即浸泡于2.5%戊二醛固定液中进行前固定，用1%锇酸进行后固定，按电镜制作样要求进行脱水、渗透、包埋、聚合，U1tracut E超薄切片机切片醋酸铀、柠檬酸铅双重染色，JEM－1200EX透射电镜观察。

3 结果

3.1 荔枝核提取液对流感病毒FM1株所致小鼠的死亡保护作用 实验中发现，小鼠感染病毒后出现耸毛、蜷缩、毛无光泽、活动减少、体重减轻的状态，大多于第七日开始死亡。实验结果经X2分析，见表1。

表1 荔枝核提取液对小鼠体内感染病毒的死亡保护作用

结果表明正常组无小鼠死亡，其余各组均有小鼠死亡，且模型组小鼠死亡最多 (P＜0.05);利巴韦林及荔枝核高、低剂量组死亡率均显著低于模型组 (P＜0.05)。该结果提示荔枝核提取液在小鼠体内有一定的抗流感病毒FM1株的作用。

表2 荔枝核提取液对小鼠流感病毒性肺炎的影响 (±s)

表2 荔枝核提取液对小鼠流感病毒性肺炎的影响 (±s)

注:经计算机统计软件包SPSS 11.0方差分析，与病毒对照组相比，*P ＜0.05;＊＊P ＜0.01。

组别 剂量g/kg n 肺指数均数 肺指数抑制率 (%——病毒对照 —— 10 1.433±0.496 ——利巴韦林 0.075 10 0.871±0.128＊＊39.2荔枝核高剂量 0.3 10 0.930 ±0.265*35.1荔枝核低剂量 0.1 10 0.947 ±0.149＊＊)正常对照 —— 10 0.667±0.040 33.9

3.2 荔枝核提取液对流感病毒FM1株所致小鼠的肺炎的抑制作用 由实验可知，与病毒对照组相比，利巴韦林及荔枝核高、低剂量组肺指数明显较低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结果表明，荔枝核提取液能显著改善小鼠感染的甲1型流感病毒的肺指数和肺指数抑制率，对FM1病毒感染的肺炎具有一定的抑制作用。见表2。

3.3 荔枝核提取液对小鼠肺炎治疗作用的光镜观察结果

小鼠肺组织HE染色光镜下观察发现，正常组小鼠肺组织中肺泡正常 (图2)病毒对照组中，可见大量小鼠肺泡充血，白细胞浸润现象 (图2)阳性照药物利巴韦林组0.075 g/kg，荔枝核提取液高低剂量组0.3 g/kg、0.1 g/kg，的小鼠肺组织切片中，虽可见肺泡充血和白细胞浸润现象，但与病毒对照组相比有明显改善 (图3－5)。(HE staining×250)

3.4 荔枝核提取液对小鼠肺炎治疗作用的透射电镜观察结果 电镜观察结果表明，正常对照组肺细胞未发生形态学改变 (图1)，病毒对照组鼠肺细胞，多处肺泡壁表面有大量流感病毒，从切片中观察到流感病毒在肺组织细胞中的繁殖与释放，大量病毒颗粒的纵切面与横切面可见病毒表面的纤切亚单位，病毒所在部位的肺组织细胞出现细胞膜增厚或模糊不清 (图2);而阳性药物利巴韦林组0.075g/kg，及荔枝核提取液高低剂量组0.3g/kg、0.1g/kg治疗后的肺细胞虽可见部分流感病毒颗粒，但与病毒组相比病毒颗粒明显减少且细胞膜没有明显增厚现象 (图3－5)。

4 讨论

流感是以流感病毒为病原体的一种常见传染病，甲型流感病毒又可根据16个血凝素 (Hema1utinin，H A)和9个神经氨酸苷酶 (Neuraminidase，N A)组合成不同亚型，均具有抗原性［8］。其危害主要在于流感严重的并发症，常危及婴幼儿、老年人及免疫功能低下者的生命。因此结合中医理论利用现代医学研究开发中草药，对于防治流感及其并发症的发生，减少因流感所致的死亡具有重要的意义。

荔枝核又名大荔核，具有行气散结、祛寒止痛，抗病毒的作用，是我国南方常见的药物，其抗病毒作用是多种化学成分综合作用的结果。国内外学者对荔枝核抗病毒实验做了大量研究，有关荔枝核体外抗呼吸道合胞病毒及体外抗单纯疱疹病毒作用的研究表明荔枝核黄酮类化合物在Hep－2细胞中对呼吸道合胞病毒和单纯疱疹病毒1型有明显的抑制作用［9］。

为此，本实验进行荔枝核提取液抗流感病毒效果的初步探讨，结果表明荔枝核提取液对小鼠病毒性肺炎的发生具有明显的预防保护作用。适当剂量的荔枝核提取液可以降低流感病毒感染导致的小鼠死亡率或延长感染小鼠的平均存活时间，减轻流感病毒感染小鼠肺部病变的程度，且电镜与光镜显微观察结果也证实了这点。然而将荔枝核提取液在本实验高剂量的基础上加大剂量，观察其对肺炎的抑制作用，结果提示剂量提高到1g/mL以上后，其疗效随剂量增加反而下降，并出现毒副作用 (待发表资料)。有研究推断该现象可能与中药是通过增强机体自身免疫系统而发挥作用有关，剂量过高反而抑制机体免疫系统，但此其具体发生机制有待进一步研究。经透射电镜观察的结果也表明，荔枝核提取液对流感病毒在小鼠肺中的增殖有明显的抑制作用，在一定剂量下，其抑制病毒作用甚至与阳性对照相当，为该药发挥临床作用提供可靠实验依据，也为中药抗病毒作用提供了广泛的应用前景。

［1］江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海:上海人民出版社，1977:1616.

［2］潘竞锵，郭洁文，韩超，等.荔枝核的药理实验研［J］.中国新药杂志，2000，9(1):14－16.

［3］梁荣感，刘卫兵，唐祖年，等.荔枝核黄酮类化合物体外抗呼吸道合胞病毒的作用［J］.第四军医大学学报，2006，27(20):1881－1883.

［4］罗伟生，龚受基，梁荣感，等.荔枝核黄酮类化合物体外抗流感病毒作用的研究［J］.中国中药杂志，2006，31(16):1379－1380.

［5］徐庆，陈全斌，易祥辉，等.荔枝核提取物对HepG2.2.15细胞系HBsAg与 HBeAg表达的影响 ［J］.中国医院药学杂志，2004，24:326－329.

［6］Zheng MS，Zheng YF.Experimenta1 studies on the inhibition effects of 1000 Chinese medicimina1 herbson the surfface antige of hepatitis B virus ［J］.Traditiona1 Chin Med，1992，12(3):193.

［7］郭元吉.流行性感冒病毒及其实验技术［M］.北京:中国三峡出版社，1997，94～96，100～106.

［8］Hori moto T，kawaoka Y.Innuenza:1essons from past pandemics，warnings from current incidents［J］.Nat，Rev Microbio1 2005，3(8):591 －600.

［9］魏金亮，徐珍，等.荔枝核黄酮体外抗单纯疱疹病毒的作用［J］，武汉大学学报，2009，30(1):89－92.