风湿性心脏病合并房颤及左房内血栓患者一氧化氮合酶表达的研究

冯增斌，王振潮，王爱辉，房大广

(承德医学院附属医院，河北承德067000)

风湿性心脏病患者常合并心房颤动(简称房颤)，而房颤患者又常见左房内附壁血栓形成，其具体机制尚不十分清楚。一氧化氮(NO)具有强大的抗血栓作用，能抑制血栓形成［1］。NO在心血管系统主要由内皮型一氧化氮合酶(eNOS)合成，而eNOS RNA则是调节eNOS合成的重要基因。本课题旨在研究风湿性心脏病合并房颤、左房内血栓形成患者，血清中NO含量、心房组织内eNOS的表达变化，探讨风湿性心脏病患者附壁血栓形成的可能机制。

1 资料与方法

1．1 临床资料 选择我院2007年2月～2009年 12月行风湿性心脏病瓣膜置换手术患者50例，术前常规行心电图和心脏彩色多普勒检查，根据有无房颤和附壁血栓分为3组。A组:风湿性心脏病不伴心房颤动、未合并左房内血栓形成患者20例，男9例、女11例，年龄(41±13)岁，其中二尖瓣狭窄13例、二尖瓣狭窄伴关闭不全7例，超声均报告无左房内附壁血栓，左房径(52±14)mm，EF值47% ±10%，心功能Ⅱ～Ⅲ级。B组:风湿性心脏病伴房颤、未合并左房内血栓形成14例，男3例、女11例，年龄(46±13)岁，其中二尖瓣狭窄8例、二尖瓣狭窄伴关闭不全5例、二尖瓣狭窄伴关闭不全及三尖瓣关闭不全1例，均于手术前心电图示房颤，超声报告无左房内附壁血栓，左房径(52±14)mm，EF值47% ±10%，心功能Ⅱ～Ⅲ级。C组:风湿性心脏病伴心房颤动、左房内血栓形成患者16例，男7例、女9例，年龄(49±11)岁，其中二尖瓣狭窄5例、二尖瓣狭窄伴关闭不全7例、二尖瓣狭窄伴关闭不全及三尖瓣关闭不全患者4例，均于手术前心电图示房颤。超声均报告有左房内附壁血栓并于手术中证实，左房径(56±10)mm，EF值44% ±6%，心功能Ⅱ～Ⅲ级。以上患者均除外感染、风湿活动、糖尿病、脑卒中、急性冠脉综合征。

1．2 标本制备 上述3组患者均在全麻下行心脏直视手术，术中于转机前在左心耳处抽取血液3 ml，肝素抗凝。切取左心耳0．5 cm3大小心肌组织，结扎左心耳。心肌标本置入液氮中保存。将血液标本2 000 r/min离心5 min，分离血清，-20℃保存待测。

1．3 NO2-/NO3-含量测定 采用硝酸还原酶法测定血清样品中NO2-/NO3-的含量，具体方法参照说明书，灵敏度2 μmol/L，试剂盒为南京建成生物制品公司生产。

1．4 eNOS蛋白表达测定 心肌组织4 μm连续切片。应用鼠抗人eNOS抗体，即用型SABC免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒(均购自武汉博士德公司)。切片脱蜡至水，经3%H2O2预处理，5%BSA室温封闭20 min，鼠抗人eNOS抗体和羊抗鼠IgG抗体依次反应和洗涤后，以DAB显色试剂盒显色，苏木精复染核，酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。全部标本实验条件一致，PBS代替一抗作为阴性对照。以胞质或胞膜呈均一棕黄色颗粒的细胞为阳性，无棕黄色颗粒者为阴性。

1．5 eNOS mRNA表达检测 采用TRIzol提取组织总RNA，采用SYBR Green实时检测的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测心肌组织中eNOS mRNA的表达(PE 9600荧光定量PCR仪，美国Perkin Elmer公司生产)。PCR体系(50 μl):5×SYBR Green 10 μl，2 U/μl Taq 酶 1．5 μl，25 mmol/L dNTP 0．5 μl，10 pmol/μl上游引物 1 μl，10 pmol/μl下游引物1 μl，cDNA 模板 5 μl，双蒸水 31 μl。反应条件:93℃ 3 min，1个循环;93 ℃ 1 min，55℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40个循环，于每循环延伸反应最后时刻收集荧光信号。标准曲线制备:10倍梯度稀释标准品，各取2．5 μl做定量PCR模板，反应体系及条件同上，同时设定阴性对照。以稀释倍数的对数为横坐标，循环域值(Ct)为纵坐标，ABI Prism7000软件分析系统可自动绘制出标准曲线，并得到相应各待测样本的Ct值和起始拷贝数。

1．6 统计学方法 采用SPSS11．5软件进行统计学分析，实验数据用±s表示，计数资料比较采用χ2检验，组间比较用完全随机的单因素方差分析。以P≤0．05为有统计学差异。

2 结果

2．1 NO-2/NO-3含量 A、B、C组血清中NO-2/NO-3含量分别为(13．5 ± 1．9)、(9．2 ± 1．6)和(7．4 ±1．2)μmol/L，与A 组比较，B、C 组NO-2/NO-3含量减低，P＜0．05;B、C组间比较，差异无统计学意义(P＞0．05)。

2．2 eNOS蛋白表达 eNOS蛋白阳性染色呈棕黄色颗粒，A、B、C组左心耳心肌eNOS蛋白阳性表达率分别为65%、57．1%和43．8%，B、C 组少于A 组，P ＜0．05。

2．3 eNOS mRNA表达 A、B、C组左心耳心肌组织eNOS mRNA 表达量分别为(9．5±1．4)×106、(4．5 ±1．6)×106和(3．8 ±1．3)×106copies，B、C组少于 A 组，P ＜0．05。

3 讨论

由于NO极不稳定，直接测量十分困难，NO2-和NO3-是NO的稳定代谢产物，测量NO2-和NO3-的总量可以较好地反映NO的水平。本研究表明，房颤尤其是合并有左房内血栓患者，血清NO2-/NO3-含量明显下降。这说明房颤尤其是合并有左房内血栓时，血清中NO水平明显下降［2］。

本研究结果表明，房颤患者尤其是合并有血栓患者，左房心肌组织eNOS蛋白和mRNA表达明显下降。eNOS是内皮细胞NO合成的限速酶，表达受血流介导的切变应力调节，在低血流部位表达下调。房颤时心房丧失了节律性收缩，在心房内形成湍流，可能引起心内膜 eNOS表达下调及功能异常［2］。eNOS正常表达，有赖于血管内皮细胞功能的正常，窦性心律下稳定的层状血流和血管剪切力等因素。任何一个因素改变都会影响eNOS的表达。心房颤动时心室有效充盈减少，血流剪切力下降，可使eNOS的表达减少［3］。另外，血流动力学紊乱，心律不规则出现湍流，会明显降低eNOS的生物活性，加之内皮细胞的损伤都会使NO的生成减少［4］。NO分泌减少使其对血小板的抑制作用减弱，纤溶酶原激活物抑制剂1表达增加，血小板易于聚集和黏附于受损的内皮，导致最终促进左房的血栓形成。因此，我们认为左房心肌组织eNOS的蛋白和mRNA表达明显下降，导致NO生成减少，可能是风心病患者附壁血栓形成的机制。

［1］Rastaldo R，Pagliaro P，Cappello S，et al．Nitric oxide and cardic function［J］．Life Sci，2007，81(10):779-793．

［2］Cai H，Li Z，Goette A，et al．Downregulation of endocardial nitric oxide synthase expression and nitric oxide production in atrial fibrillation:potential mechanisms for atrial thrombosis and stroke ［J］．Circulation，2002，106(22):2854-2858．

［3］Bukowska A，Röcken C，Erxleben M，et al．Atrial expression of endothelial nitric oxide synthase in patients with and without atrial fibrillation ［J］．Cardiovasc Pathol，2010，19(3):51-60．

［4］Guazzi M，Arena R．Endothelial dysfunction and pathophysiological correlates in atrial fibrillation ［J］．Heart，2009，95(2):102-106．