柴胡有效成分提取分离方法的研究进展

陈 朝,伍小燕

(广西中医学院第一附属医院药学部,广西南宁,530023)

柴胡为伞形科柴胡属植物柴胡.或狭叶柴胡的根,始载于《神农本草经》,原名茈胡、地薰,列为上品,宋代《图经本草》始易其名为柴胡[1]。其味苦,性微寒。具和解表里、疏肝、升阳之功效,药理学研究证明柴胡具有解热、镇痛、镇静、抗炎、免疫增强、保肝利胆、抗菌、抗病毒及抗肿瘤等作用,是常用中药之一。柴胡中含有柴胡皂苷、挥发油、柴胡多糖、黄酮等多种有效成分,柴胡有效成分的提取分离多样化,如溶剂提取法、超临界流体萃取法(SFE)、高效液相色谱法(HPLC)、固相微萃取法(SPME)等,作者对柴胡有效成分提取分离方法的研究进展做一综述,以利进一步的研究与开发利用。

1 柴胡皂苷的提取分离方法

柴胡皂苷为柴胡的主要有效成分,其结构均为五环三萜类齐墩果烷型衍生物,兼有亲水性(糖链)和亲脂性部分(苷元等)。主要的提取分离方法有溶剂提取法、超临界CO2萃取法,大孔吸附树脂法等。

1.1 溶剂提取

根据中药中各种成分在溶剂中的溶解性质,选用对有效成分溶解度大,对不需要溶出成分溶解度小的溶剂,而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。常用浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流法及连续回流提取法等。翁丽丽等[2]以柴胡总皂甙为考察指标,通过水煎提取工艺的正交试验确定了柴胡最佳提取工艺条件:维持pH8-9,预先浸泡6 h,提取3 h,再进行第2次提取2 h,其提取率可达0.883%。刘伟等[3]采用正交试验,以柴胡皂苷a、d为指标,确定最佳提取方法为加5%氨水甲醇30 mL,回流1 h,且回流方法相对优于超声提取法。柴胡皂苷a、c、d均为热不稳定物质,提取分离时易发生化学变化[4],当柴胡皂苷a、d降解后,生理活性大大降低,张相年等[5]采用60%的乙醇在低于55℃下提取柴胡粉末,滤液去溶剂后所得的浆状液加入正丁醇,在低于55℃去除溶剂得皂苷粉末,结果柴胡总皂苷的收率为1.1%,富含皂苷a、c、d成分。

1.2 超临界CO2萃取

超临界流体萃取(SFE)技术是以超临界流体(SCF)为溶剂,可应用于多种液态或固态混合物中待分离组分的萃取。当二氧化碳处于临界状态(温度31.26℃,压力7.36×103kPa)时即为超临界流体。侯彩霞等[6]将传统的水提醇沉法与CO2超临界萃取法(SFE-CO2)进行比较,得出SFE-CO2所得浸膏收率约为水提醇沉提取所得浸膏的6倍,浸膏中柴胡皂苷a含量约是水提醇沉工艺提取的2倍。这是由于传统方法多数都有加热过程或产热过程,而SFE-CO2受热小,并且同时具有液体溶剂的溶解能力和气体的传递特性,萃取后溶质和溶剂易于分离等优点,特别适合于热敏性、易氧化物质的分离或提纯。而柴胡皂苷a和d受热容易导致水解变性,这就是传统提取分离方法的提取率较超临界萃取法提取率的缘故。

1.3 大孔吸附树脂

大孔吸附树脂是一类不含离子交换基团的交联聚合物。通过其本身多孔性结构而达到筛选效果。它的吸附性是由于范德华引力或生成氢键的结果。由于吸附和分子筛的双重作用,有机化合物可根据吸附力及相对分子质量大小的不同,被吸附树脂吸附后再经一定溶剂洗脱而被分离[7]。具有吸附容量大、再生简单、效果可靠等优点,尤其适用于苷类、黄酮类、皂苷类、生物碱类等成分的提取分离及大规模生产。宋海妹等[8]用大孔吸附树脂AB-8分离提取了柴胡皂苷b2,并得出大孔吸附树脂层析法的最佳工艺:先用30%乙醇除杂,后用4倍柱体积70%的乙醇洗脱2个糖基或3个糖基的柴胡皂苷,柴胡总皂苷的提取率为1.96%。

1.4 硅胶柱层析

硅胶柱层析的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而实现分离,常用于单体组分的分离。刘绣华等[9]利用硅胶柱色谱法,经溶剂萃取、硅胶柱层析及RP-8硅胶柱层析、IR、UV、DMS、1HNMR、等现代波谱分析过程,从三岛柴胡的种子中分离出皂甙d、6′-乙酰皂甙d。Liu等[10]采用相同方法首次从北柴胡分离出皂苷v-1、6′-乙酰皂甙 b2。此外,反相硅胶树脂在中药有效成分提取分离上日渐增多。Tan等[11]使用反相凝胶柱色谱将15 g粗皂苷分离成21流分,第16流分经RP-18色谱分离得到20 mg柴胡皂苷r。

1.5 高效液相色谱

高效液相色谱(HPLC)是60年代兴起的新技术,兼具分离和分析功能,具有分析速度快、效率高、灵敏度好、选择性强、有效成分与杂质较好地分离等优点,已逐渐成为中药有效成分一种首选的分离分析方法。马林等[12]利用HPLC法,以甲醇-水(66∶34)为流动相,直接分离柴胡皂甙a、c、d。李媛媛等[13]采用HPLC-UV 法和中药指纹图谱相似度评价软件,建立了北柴胡的纹图谱的测定方法,该指纹图谱的提取、测试、分析方法对柴胡类药材具有较好的分离效果和较广泛的应用范围。

1.6 高效毛细管电泳

毛细管电泳(HPCE)是以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。它可实现很小体积带电或不带电组分的快速、高效分离。丁原菊等[14]以环糊精衍生物2-O-丙酮基-2-O-羟丙基-环糊精(2-AHP-β-CD)作为手性选择剂,运用毛细管电泳快速分离、测定柴胡中柴胡皂甙a,d对映体。考察了手性选择剂浓度、缓冲液浓度及其pH值对分离效果的影响,并确定了最佳电泳条件:缓冲液pH值8.0;2-AHP-β-CD浓度:5 mmol/L;硼砂浓度:40 mmol/L;分离电压:20 Kv;电动进样:20 KV/5 s;温度:22℃;检测波长:214 nm。在214 nm检测波长处,在硼砂缓冲溶液中,2-AHP-β-CD能使柴胡皂甙a,d异构体在7 min内得到分离和测定。2柴胡中挥发油的提取分离方法。

柴胡的挥发性成分含量较低,约占根的0.15%,有明显的辛辣、芳香气味。挥发油是解热的主要有效部位之一[15],所以挥发油成分的提取分离也是比较活跃的研究领域。其提取主要有药典法、水蒸气蒸馏法[16]、蒸馏法和SFE-CO2[17]、SPME[18]。

葛发欢等[17]对SFE-CO2和水蒸气蒸馏法提取柴胡挥发油化学成分进行了比较,SFECO2法和水蒸气蒸馏法得到的挥发油组成相同,提取率分别为1.86%和0.24%,提取时间分别为4 h和12 h,可见SFE-CO2法比水蒸气蒸馏法提取率提高,提取时间缩短。李秀琴等[19]通过对多种提取工艺(药典法、水蒸气蒸馏法、蒸馏法)和SFE-CO2的比较,结果SFE-CO2的得油率为0.46%,约高出其他方法7倍,但不同的提取方法所得挥发油的化学成分及其含量差异较大。

SPME为一种非溶剂型选择性萃取法,具有方法简便、无需试剂、提取效果好等优点。曾栋等[18]采用固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术检测分离分析干柴胡药材中26种挥发性成分,较传统共水蒸馏提取法操作简单、快速、样品量少,且避免了有些药物挥发性成分在传统提取法的高温条件下的热不稳定性,使结果更能反映出药材实际挥发性成分。

3 柴胡中其他成分的提取分离方法

柴胡有效成分的研究除上述柴胡皂苷、挥发油成分外,其他一些具有生物活性的成分也取得了一定的研究进展。张亮等[20]采用煎煮法从南柴胡中提取分离出柴胡多糖,得率为1%,应用高分辨毛细管气相色谱确定多糖主要由L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖等单糖组成。

梁鸿等[21]用硅胶柱色谱法从北柴胡分离得8个黄酮类化合物:柴胡色原酮酸,芦丁,槲皮素,异鼠李素,异鼠李素3-O-葡萄糖甙,葛根素,7,4′二羟基异黄酮 7-O-β-D-葡萄糖甙,色氨酸。

马文兵等[22]采用正交试验考察了提取温度、时间、乙醇浓度和料液比对总黄酮得率的影响,确定总黄酮最佳工艺:提取温度80℃,70%乙醇,料液比1∶30,回流提取2 h,总黄酮得率可达到3.41%。

Li等[23]用凝胶柱色谱方法从北柴胡根分离得到碳三十醇、α-菠甾醇、柴胡色原酮A、富马酸和琥珀酸等。Liang等[24]用同样方法分离得水仙苷、腺苷、尿苷、α-菠甾醇葡萄糖苷和木糖醇。

王宁等[25]对北柴胡地上部分的水提物用硅胶吸附柱色谱和凝胶柱色谱的方法结合理化性质分析和波谱学手段(UV、NMR),分离得到β-谷甾醇、山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷、山柰酚-3,7-二-O-α-L-鼠李糖苷、7-羟基-2,5-二甲基-色原酮。

4 小 结

目前,柴胡有效成分的提取分离存在提取率不高,分离纯化困难,有效成分纯度低等问题。SFE-CO2、大孔吸附树脂、硅胶柱层析、HPCE、HPLC等新技术取得很大发展,具有广泛的应用前景,但多为实验室研究阶段,实现工业化生产尚需一定时间。因此,柴胡有效成分的提取分离研究有待进一步开展。

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