脂多糖对肝细胞烟酸受体表达及胆固醇外流的影响

李晓宇,杨 清,单 清

(1.南京医科大学江苏省心血管病分子干预重点实验室,江苏南京,210029;2.江苏省扬州市第一人民医院,江苏扬州,225001)

大量流行病研究证实高密度脂蛋白(HDL)及其主要的蛋白成分-载脂蛋白A-I(apoA-I)含量的高低与患心血管病的风险呈负相关,被认为是抗动脉粥样硬化的保护因子[1-2]。急性或慢性炎症状态时下高密度脂蛋白和载脂蛋白AI含量降低[3-4],但其发生机理不详。

GPR109A是一种G蛋白偶联受体[5-8],其基因在脂肪组织和活化的免疫细胞中高表达。现有的研究发现脂肪组织中GPR109A激活可以抑制腺苷酸环化酶活性从而抑制环磷腺苷的生成,降低蛋白激酶A的活性,减少脂肪细胞中甘油三酯脂解,进而减少游离脂肪酸的释放,进而降低甘油三酯和低密度脂蛋白含量。作者的前期研究[9]发现肝细胞中GPR109A的过表达,可以降低细胞内环磷腺苷的释放,而抑制肝细胞中ABCA1活性,使得肝细胞介导的游离胆固醇向新生apoA-I外流减少,从而降低HDL浓度。

生理状态下小鼠巨噬细胞中GPR109A的表达量并不高,但炎症刺激可大量激活其表达[10]。肝细胞中的GPR109A是否也有类似的调控规律,以及炎症应激下的GPR109A是否参与了HDL减少的调控过程,目前均不清楚。本研究旨在探讨炎症应激对肝细胞GPR109A表达的影响,及其对HDL代谢的潜在影响。作者的研究结果提示,低剂量LPS注射可以在2 h内迅速上调小鼠肝细胞GPR109A的表达,而不是仅诱导了Kupffer细胞中GPR109A的表达上调。同时,作者也在人的肝细胞株上验证了相同的结果。此外,作者发现炎症上调的GPR109A抑制了肝细胞中环磷腺苷的释放,也降低了游离胆固醇外流至新生的apoA-I。作者的研究表明炎症应激时肝细胞中上调的GPR109A参与了血浆HDL减少的调节过程,从而提高了心血管事件发病的危险性。

1 材料和方法

1.1 试剂

烟酸(niacin),福斯高林(Forskolin),3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX),Percoll细胞分离液、脂多糖(LPS)购自美国西格玛奥德里奇(sigma-aldrich)公司。生理盐水由南京化学试剂厂生产。环磷腺苷(cAMP)酶联免疫试剂盒由美国R&D公司提供。氚标记的胆固醇(3H-cholesterol)购自美国铂金埃尔默公司(Perkin Elmer Life Sciences)。RPMI-1640培养基、DMEM 培养基、Williams E培养基、肝脏灌注液、肝脏消化液、肝细胞漂洗液、Hank′s液 ,青链霉素混合液和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购于美国Invitrogen公司。

1.2 细胞培养

人肝细胞癌细胞株HepG2和小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞购自美国模式培养物集存库(ATCC),用含10%胎牛血清的DMEM培养基,在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。实验前,按每孔2×105细胞数接种于六孔板。

取成年雌性C57BL/6小鼠用门静脉灌流法结合Percoll单密度梯度离心法分离小鼠原代肝细胞和Kupffer细胞[11]。腹腔注射70/7 mg/kg氯胺酮和赛拉嗪混合液麻醉小鼠后,无菌操作打开腹腔,切断下腔静脉,从门静脉插管,分别用肝脏灌注液和肝脏消化液原位灌流。收集并剪碎消化好的肝脏,离心,清洗,用 Percoll分离液筛选活的原代肝细胞,以2×105的密度培养在预铺胶原酶I的十二孔细胞板上。用含10%胎牛血清加双抗的Williams E培养原代肝细胞。上清液继续高速离心,取沉淀用 Hank′s液稀释,30%～70%Percoll分离液梯度离心后取两层Percoll之间的一层细胞,RPMI-1640液清洗两遍,10%FBS培养于12孔板,两小时后PBS清洗3遍,去除非贴壁细胞。

小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞、J774细胞,小鼠腹腔巨噬细胞(MPM)和小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMM)的cDNA由美国宾夕法尼亚大学医学院的李辉博士馈赠。

1.3 动物试验

6～8周雌性C57BL/6J小鼠购自美国Jack-son实验室,饲予普通啮齿类动物颗粒,于12 h明暗交替,室温18～23℃的动物房内饲养。所有的实验操作均经过南京医科大学动物伦理委员会批准。小鼠随机分组后腹腔注射 625 μ g/kg的LPS。在不同的时间点,处死动物,行冰PBS心脏灌洗后收集肝脏。组织于RNAlater液体中4℃过夜后,转存-80°C低温冰箱保存。

1.4 RNA提取及定量PCR

用德国QIAGEN公司的EZ1 RNA Mini Kit试剂盒,按照说明书提取组织及细胞的总RNA。紫外分光光度计鉴定OD260/OD280比值高于1.8。取 1 μ g总 RNA 用美国ABI公司的High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit试剂盒反转录成 cDNA。用美国ABI公司的Applied Biosystems 7300进行实时定量PCR反应。引物序列如下:人GPR109A上游5′-ACAACTATGTGAGGCGTTGGGA-3′, 下游 5′-TGGCGGTTCATAGCCAACA-3′,荧光探针 6FAMATCAGCCGGCAAGGGATGTCC-MGXBP;人GPR109B上游 5′-ACTACTATGTGCGGCGTT CAGAC-3′,下游 5′-GGCGGTTCATGGCAA ACA-3′,荧光探针6FAM-ACCAGCCGGCAA GGGATGTCC-MGXBP;人 GPR81上游 5′-GGGTGAGTGCTAACGCTCAGATAAG-3′,下游 5′-AGAAGCCGTCT TGCAATAAGAAAGG-3′,荧光探针6FAM-CATGGTGGTGGCT TC TGTGTT-BHQ;人血清淀粉样蛋白(serum amyloid A,SAA)上游 5′-GCTGACCAGGAAGC CAACAG-3′,下游 5′-CAGGCAGTCCAGGAG GTCTG-3′,荧光探针 6FAM-CATGGCCGCAGTGGCAAAGACC-TAMRA;人诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)上游 5′-CATTGGAAGTGAAGCGTTCG-3′,下游 5′-CAGCTGGGCTGTACAAACCTT-3′荧 光 探 针 6FAM-CGGGCAGCCTGTGAGACCTTTGA-TAMRA;看家基因人β-actin上游 5′-CTCCTCCTGAGCGCAAGTACTC-3′,下游 5′-TCGTCATACTCCTGCTTGCTGA T-3′,荧光探针 6FAM-CCATCCTGGCCTCGCTGTCCA-TAMRA;小鼠巨噬细胞的标记基因 Mac-2上游 5′-AGGAGAGGGAATGATGTTGCC-3′, 下 游 5′-GGT TTGCCACTCTCAAAGGG-3′,荧光探针6FAM-TCCACTT TAACCCCCGCTTCAATGAGA-TAMRA;小鼠 GPR109A 上游 5′-CCCT TGCCGTGTGATGCT-3′, 下游 5′-ACCACGGTGAGGAAGATGATG-3′,荧光探针 6FAM-ATGTTGGCTATGAACCGACAGGGCA-BHQ;看家基因小鼠 GAPDH上游 5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′,下游 5′-GTCTTCTGG GTGGCAGTGATG-3′荧光探针6FAM-GGAA GGGCTCATGACCACAGTCCA-TAMRA。

1.5 细胞内环磷腺苷测定

十二孔细胞培养板中的单层HepG2细胞用10 ng/mL LPS或盐水孵育48h后,先用无血清的DMEM培养液清洗,然后用腺苷酸环化酶刺激剂福斯高林30 μ mol/L及磷酸二脂酶抑制剂IBMX 0.1mg/mL作用15 min。参照检测说明,收集细胞裂解液,用酶联免疫吸附法测定。

1.6 胆固醇外流试验

实验前1 d,取预铺胶原酶I的二十四孔细胞板,以每孔1×105的密度将HepG2细胞种板。用含2 μ Ci/ml 3H标记的胆固醇和1%的FBS的DMEM培养液在37℃标记细胞24 h。随后弃胆固醇孵育液,用无血清培养基洗板3次,再置细胞于含或不含 LXRα激动剂 TO901317的DMEM培养液中过夜。另外,LPS组细胞予以10 ng/mL的LPS孵育。细胞同步化后,加入含10 μ g/mL载脂蛋白A-I的胆固醇诱导流出液继续孵育。24 h后,取细胞上清高速离心弃沉淀测液闪计数。用0.1 N的氢氧化钠溶液裂解培养板中的细胞,并用液闪计数器计数。胆固醇外流率=外流液计数/(外流液计数+裂解液计数)100%。

2 结 果

2.1 小鼠GPR109A在巨噬细胞和肝脏细胞中的分布

烟酸受体在脂肪组织高表达,在巨噬细胞、肝细胞中的表达均低。为观察生理状态下肝细胞中烟酸受体的表达水平,作者收集了巨噬细胞株RAW264.7、J774,以及3种小鼠原代巨噬细胞的腹腔巨噬细胞、骨髓源性巨噬细胞、肝脏的Kupffer细胞,小鼠空肠组织以及小鼠原代肝细胞的cDNA,用定量PCR法检测小鼠GPR109A的mRNA表达水平。结果提示除小鼠骨髓源性巨噬细胞外,小鼠腹腔巨噬细胞、肝脏Kupffer细胞、RAW264.7细胞、J774细胞中均有较高水平的GPR109A表达。Mac-2,又名半乳糖素-3(lectin-3),是巨噬细胞的标记基因,本研究中骨髓源性巨噬细胞有很强的Mac-2,但GPR109A的表达水平缺如;而小鼠腹腔巨噬细胞的Mac-2及GPR109A表达水平均很高。小鼠的空肠组织被用作阴性对照,既没有检测到Mac-2也没有GPR109A表达。小鼠原代肝细胞中Mac-2的表达水平非常低,但仍有一定程度的GPR109A表达。

2.2 注射LPS后小鼠肝脏GPR109A基因的表达上调

文献报道巨噬细胞在炎症刺激时会上调GPR109A的表达[10],为观察肝细胞中GPR109A的表达是否会受炎症刺激而上调,作者给小鼠注射了低剂量的脂多糖。实验发现接受 LPS注射后两小时,小鼠的肝脏组织中有大约700多倍的GPR109A。因为肝脏组织中有10%～15%的Kupffer细胞,一种原位的肝脏巨噬细胞,作者观察到的GPR109A表达上调到底是源自肝脏组织中的Kupffer细胞,还是真的源自肝细胞自身。为此,注射过LPS的小鼠的原代肝细胞被新鲜分离,然后提取 RNA,做 RT-PCR。结果提示LPS刺激后肝细胞的GPR109A表达上调了600倍,略低于在肝脏组织的上调倍数。提示肝脏的肝细胞自身可以应对炎症反应而上调GPR109A,而不单纯是 Kupffer细胞应对炎症反应后上调GPR109A。诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和血浆淀粉样蛋白A都是LPS刺激后肝脏组织炎症反应的下游基因,结果显示无论是肝脏组织还是肝细胞中的iNOS与SAA表达都受到LPS的刺激表达水平明显增高,提示LPS的注射有效。

2.3 LPS上调HepG2细胞GPR109A基因表达

已经发现炎症反应可以促进在体的小鼠肝细胞中GPR109A的表达增加,这种反应是否也存在于人肝细胞呢?作者用低剂量的 10 ng/mL LPS处理 HepG2细胞,发现 LPS的下游基因SAA成千倍的增长,证明LPS的处理有效。同时,作者发现LPS处理12小时开始GPR109A的表达显著增多,并且随着孵育时间的延长而明显增强。人的GPR109B和GPR81与GPR109A 3个基因高度同源,其中GPR109B与GPR109A更是分享了高达 96%的同源性,而GPR81也有60%的序列与 GPR109A相同。GPR109B和GPR81的表达是否也受炎症应答而上调,尚不得而知。作者的结果表明,长时间的LPS处理也能上调GPR109B和GPR81的表达,只是其上调的倍数远低于GPR109A。

2.4 LPS处理降低人肝脏细胞内cAMP释放

GPR109A作为一种抑制型G蛋白偶联受体,活化后可以抑制细胞内的cAMP释放,从而抑制蛋白激酶A的活性。既然作者的研究发现炎症应激可以上调肝细胞中的GPR109A,作者又接着观察小剂量长时间炎症过程是否影响肝细胞内cAMP的释放。长时间LPS刺激使HeG细胞cAMP释放明显减少,这证明炎症应答时表达增多的GPR109A确为活化的抑制型G蛋白偶联受体。

2.5 LPS处理降低人肝脏细胞胆固醇外流至apoA-I

肝细胞的GPR109A在炎症过程中上调,为进一步了解其在脂代谢尤其是新生HDL的形成中的作用,作者观察了LPS刺激对肝细胞的胆固醇外流的影响。结果表明,长时间的LPS刺激对于静息状态下HepG2细胞的胆固醇外流并无影响,但是在LXRα路径激活情况下的胆固醇外流至apoA-I明显减少。

3 讨 论

G蛋白偶联受体GPR109B,GPR81与GPR109A高度同源,在人体内都是由12号染色体上的基因所编码[12]。近年这3个基因的内源性配基相继揭晓,GPR109A的内源性配基是β-羟基丁酸[13],GPR109B的内源性配基是3-羟基辛酸[14],GPR81的内源性配基是乳酸[15]。3种酸都属于羟基羧酸代谢物,所以它们也因此被重新命名为羟基羧酸(HCA)受体[16]。GPR109A和GPR81存在于大多数的哺乳类动物中,而GPR109B只在高级的灵长类动物中表达。这3种G蛋白偶联受体都在脂肪细胞中存在,并且与抑制性G蛋白偶联介导脂肪细胞的抗脂解效应。2001年,在干扰素和肿瘤因子刺激的巨噬细胞中小鼠GPR109A第一次被克隆并命名为PUMAG(protein up-regulated in macrophages by IFN-γ)[10]。杆状细菌李斯特菌感染可以诱导小鼠脾脏GPR109A的表达。人和大鼠的GPR109A随后被克隆,同时证实为烟酸受体[6-8]。GPR109A不仅在脂肪细胞,还在各种免疫细胞包括中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、表皮朗罕氏细胞中有表达[17-19],但是在小鼠和人的B细胞、T细胞或者人的嗜酸性粒细胞中却不表达[20]。与小鼠腹腔巨噬细胞、肝脏Kupffer细胞不同,在骨髓源性巨噬细胞中作者没有检测到GPR109A的表达,或许提示GPR109A的只表达在终末分化的中性粒细胞的后期。

HDL主要是由肝脏和小肠合成1。新生的HDL呈碟形,由磷脂、游离胆固醇和载脂蛋白(apo AI和apo AII)组成。新生的HDL颗粒密度高,其胆固醇含量相对较少,随着胆固醇酯的进一步掺入,使HDL的密度降低而形成成熟的HDL。周围细胞中的胆固醇在浆膜双层上的分布是不对称的,有核细胞中的胆固醇大多分布在浆膜的内层上。周围组织的胆固醇是以游离胆固醇的形式进行转移的,胆固醇的外流可通过弥散或受体介导的方式进行。在受体介导的主动的胆固醇外流过程中,HDL与细胞上的高密度脂蛋白结合蛋白结合,激活蛋白C激酶介导的信号系统从而诱导胆固醇的外流,胆固醇从内质网转移到细胞表面。ATP结合盒转运子1(ABCA1)通过利用ATP参与将脂质从细胞膜内层移至外层,再与载脂蛋白A-I结合形成HDL,从而对胆固醇的外流进行调节。肝脏的ABCA1在新生HDL合成中起重要作用,而ABCA1的蛋白表达甚至活性都受cAMP的调节[21],因此当作者发现炎症状态下GPR109A大量上调而抑制细胞内cAMP释放时,作者联想到其是否会进一步影响肝脏中游离胆固醇外流至载脂蛋白A-I。作者的实验结果证明了作者的猜想,炎症应答时上调的GPR109A可以抑制新生HDL合成。结果也提示一些促炎症病理状态例如肥胖、胰岛素抵抗等可能伴随着肝细胞烟酸受体表达增强而导致的HDL数量减少。

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