蜂胶活性成分及质量控制的研究进展

北京市保健品化妆品技术审评中心（100055） 李强 刘东红

蜂胶（propolis）是蜜蜂从植物芽孢或树干破皮伤处采集来的树脂（树胶），并混入蜜蜂上颚腺的分泌物，与蜂蜡、少量花粉等加工而成的一种具有芳香气味和黏性的胶状固体物质[1]。蜂胶是蜜蜂用于维持整个群体健康的有效物质，一个5～6万只的蜂群一年只能生产蜂胶100～150g，被誉为“紫色黄金”。蜂胶因其化学成分复杂且生物学活性广泛而成为国内外研究与开发的热点。

天然蜂胶的基本成份： 树脂50%～55%，蜂蜡30%～40%，花粉5%～10%。主要活性成分有黄酮类化合物（槲皮素、芦丁、山奈黄素、白杨黄素、芹菜素、高良姜素、松属素等）、萜烯类、有机酸（阿魏酸、咖啡酸、苯甲酸等）、脂肪酸（10-羟基-α-癸烯酸等）、氨基酸、胰蛋白酶等活性酶类、维生素、多糖、30多种微量元素和矿物质等共200余种有效成分[2][3]。

蜂胶具有抗感染、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、抗辐射；降血脂、降血糖、降血压、降胆固醇；增强免疫、清除自由基、美容、促进组织再生等作用[4][6]。蜂胶在临床内科、外科、皮肤科、耳鼻喉科、妇科、内分泌及代谢性疾病等均有应用[5][6]。

蜂胶制品有两类，一类是以水为载体的，即所谓水溶性蜂胶；另一类是以酒精为载体的，即所谓醇溶或酒精溶的蜂胶。原胶（即从蜂箱中直接取出的蜂胶）中含有杂质，而且重金属含量较高，不能直接食用，必须经过提纯、去杂、去除重金属如铅等之后，才可用于加工生产各种蜂胶制品。蜂胶的活性成分因产地、气候、储存方式、提取工艺的不同而不同，从而使蜂胶质量和功效存在差异。

蜂胶的质量控制贯穿于收购和加工的全过程，随着现代各种检测技术的不断发展，特别是近年来色谱技术的日益发展、检测手段和能力的不断增强，为蜂胶中有效成分含量测定的研究提供了良好的工作平台。采用先进的现代分析技术色谱、光谱、电泳技术以及联用技术，如气相色谱-质谱联用技术、高效毛细管电泳-质谱联用技术和高效液相色谱-质谱联用技术，通过现代仪器分析方法，分析蜂胶中的有效成分和特有的芳香物质，建立起相应的科学的质量技术评价平台和质量标准评价平台，最终推广到行业应用，从而确保蜂胶质量稳定可控，使蜂胶这一宝贵的资源能更好地造福于人类。现对蜂胶活性成分及其质量控制的几个问题做以下总结：

1 蜂胶感官的判别

农业部颁发的标准《无公害食品-蜂胶》（NY5136-2002）[1]中规定蜂胶为不透明团块或碎片，在35℃以上逐渐变软，有粘性和可塑性，有明显的芳香气味，颜色由于树种或生产季节不同呈褐色、灰褐、暗绿、灰黑色等，有光泽，有明显的辛辣感。GB/T24283-2009《蜂胶》[7]除了对蜂胶的感官有上述描述外，还对蜂胶的乙醇提取物的感官进行了规定。商业部颁发的《蜂胶》（SB/T10096-92）[8]、《蜂蜡》（SB/T10190-93）[9]则根据感官性状对蜂胶进行了分级。

2 蜂胶中黄酮类物质的含量

蜂胶产品中的蜂胶含量是有一定比例的，总黄酮含量是一个标志性成分指标，农业部颁发的标准《无公害食品-蜂胶》（NY5136-2002）规定总黄酮含量8%，GB/T24283-2009《蜂胶》中按照总黄酮含量和乙醇提取物含量的不同对蜂胶和蜂胶乙醇提取物分了二级。《无公害食品-蜂胶》（NY5136-2002）使用高效液相色谱法测定蜂胶中常见的高良姜素（galangin）、槲皮素（quercetin）、芦丁（rutin）、杨梅酮（myricetin）、莰菲醇（kaempferol）、芹菜素（apigenin）、松属素（pinocembrin）、柯因（chrysine）等8种黄酮含量，计算总和为总黄酮含量。该方法同国家质检总局国家蜂产品质量监督检验中心颁布的GB/T19427-2003[10]中的液相方法基本一致，GB/T19427-2003同时还制订了该8种黄酮的液相色谱-串联质谱检测法的测定方法。GB/T24283-2009《蜂胶》则以芦丁为对照，采用分光光度比色法测定总黄酮的含量，GB/T20574-2006[11]亦是采用分光光度比色法测定蜂胶中总黄酮的含量。

王小平等[12]用高效液相色谱法建立蜂胶指纹图谱分析方法，用以鉴别蜂胶和树胶，采用蜂胶黄酮类物质中主要成分芦丁、槲皮素、白羊素、高良姜素作为观察指标，方法学考察中精密度试验、重复性试验、稳定性试验色谱图的相似度均大于0.95。对蜂胶HPLC色谱图进行解析，确定有13个共有峰，构筑了蜂胶药材的HPLC色谱图的指纹特征，可作为蜂胶鉴别的依据。蜂胶和树胶同源，其主要化学成分基本相同但是相对含量有所不同，通过对10批蜂胶和3批树胶图谱的研究，发现蜂胶中有两种成分均甚微，而3批树胶中该两峰均较高，以此可对真假蜂胶进行鉴别。朱恩圆等[13]采用RP-HPLC梯度洗脱的方法对蜂胶总黄酮进行研究，对不同产地的蜂胶指纹图谱比较选出10个稳定的且具有代表的峰作为共有峰，建立了蜂胶的指纹图谱。沙娜等[14]应用反相高效液相色谱法使蜂胶中各成分得到较好的分离，根据检测结果确定了15个共有指纹峰，并指认了其中的14个成分，分别为咖啡酸、对香豆酸、异阿魏酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、5-甲氧基短叶松素、短叶松素、乔松素、咖啡酸卞酯、5-甲氧基高良姜素、白杨素、咖啡酸苯乙基酯、高良姜素、3-甲氧基高良姜素、咖啡酸桂皮酰酯，建立蜂胶药材指纹图谱,对蜂胶进行质量控制。李熠等[15]采用超高效液相色谱法能够同时测定蜂胶中的黄酮类物质如芦丁、杨梅酮、桑色素、棚皮素、茨菲醇、芹菜素、松属素、柯因、高良姜素、金合欢素、酸类物质如阿魏酸以及脂类物质咖啡酸苯乙酯等12种成分的含量，提供了一种更为全面的评价蜂胶质量的新方法。薛晓丽[16]则通过使用高效液相色谱法和气-质联用分析仪将现代的超临界CO2流体提取工艺与传统的乙醇浸出提取工艺相比较。结果表明，两种方法都有利于蜂胶有效化学成分的提取，乙醇浸出提取工艺有利于提取蜂胶中黄酮类物质，超临界CO2流体提取工艺有利于蜂胶中化学成分的分析，应根据提取活性成分的主次及具体情况进行选择单体成分和指纹图谱研究，建立指纹图谱库。

20世纪80年代初发展的毛细管电泳（capillaryelectrophoresis，CE）是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间的迁移速度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术，比较HPLC测定法，高效毛细管电泳法可以更好地分离多种黄酮类化合物，并可以对糖类、有机酸类同时进行测定[17]，与HPLC互补可以测定蜂胶中的芳香类化合物如酯类化合物、糖、糖醇类化合物、氨基酸、脂肪酸及黄酮类的含量。

3 蜂胶中挥发性成分的研究

蜂胶中香气挥发性成分有萜烯类、醇、醛、酮、酯等类别，其挥发性成分是一个重要的质量指标，具有指纹特征。传统的挥发性有机物富集方法为水蒸气蒸馏和同时蒸馏萃取，不能满足快速分析的要求。王小平等[18]采用GC-MS法分别对不同产地蜂胶乙醚索氏提取法所得提取物的化学成分进行分析比较，发现蜂胶的产地、生态环境等条件与蜂胶挥发油种类及含量密切相关，可考虑通过选择蜂场附近的生态环境如主要树木种类等，改善蜂胶产品的质量。李雅萍等[19]利用固相微萃取（SPME）对蜂胶挥发性成分进行提取，采用气相色谱-质谱联用技术对提取物进行定性定量研究，并与溶剂（乙醇、乙酸乙脂）提取法对蜂胶挥发性成分特别是萜烯类物质的提取效果进行了比较，建立了SPME-GC/MS联用技术分析蜂胶中香气挥发性成分的方法，得到较理想的结果。利用SPME-GC/MS联用技术对不同产地采集期的蜂胶成分进行分析，提取有用的指纹信息，为进一步分析蜂胶某些成分的药用价值及蜂胶的开发利用及指纹图谱的建立提供依据。赵强等[20]采用超临界CO2萃取和冷冻分离得到蜂胶挥发油，用化学发光法测定蜂胶挥发油对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除性能，并用色质联用法分析其化学组成。实验结果表明，蜂胶挥发油能有效抑制羟自由基和超氧阴离子自由基诱导的化学发光，通过GC-MS分析鉴定出51种化合物。

4 蜂胶中蜂蜡的研究

蜂蜡在蜂胶中占3 0%～4 0%，农业部颁发的标准《无公害食品-蜂胶》（NY5136-2002）中规定蜂蜡和75%乙醇不溶物含量≤45%。该标准采用重量法测定75%乙醇可溶物含量后，采用减量法测定了蜂蜡和75%乙醇不溶物含量。骆尚骅[21]在《蜂胶质量控制的几个指标和检测方法》一文中采用索氏提取-重量法测定了蜡类含量。

5 蜂胶中酚酸类化合物的研究

有机酸成分也是蜂胶的活性成分，其含量的变化也会影响蜂胶质量，蜂胶中的有机酸如苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸、香草酸、肉桂酸、绿原酸等，具有强烈的抗病原微生物和保护动物肝脏的作用，与蜂胶中黄酮类物质起协同作用。索志荣[22]采用高效液相色谱分析方法测定了蜂胶浸膏中咖啡酸、p-香豆酸、反式阿魏酸、肉桂酸、乔松素、白杨素和高良姜素7种多酚化合物的，并用该方法测定我国不同省份的9个蜂胶浸膏样品，为评价和控制蜂胶的质量提供科学依据。孟霞等[23]建立了高效液相色谱同时测定蜂胶中的苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸、香草酸、肉桂酸、绿原酸的方法，用于实际样品分析，取得较好结果，为测定蜂胶液中有机酸类物质提供了方法依据。国家质检总局颁布了《蜂胶中阿魏酸含量的测定方法液相色谱-紫外检测法》GB/T23196-2008[24]。周立东等[25]则采用弱碱溶解蜂胶再酸化萃取的方法纯化样品，用返滴法测定，以水杨酸作为对照品检测样品中游离酸含量，结果测定了5个不同产地的蜂胶样品的游离酸含量，方法操作简单，有助于蜂胶质量的鉴别。贺峥嵘等[26]则采用紫外分光光度仪、傅立叶变换红外光谱仪以及核磁共振谱仪等不同分析技术对贵州蜂胶中的有机酸成分进行了研究。HROBONOVA Katarina等[27]采用在线固相萃取-液相色谱法测定了蜂胶中芥草酸、奎尼酸、绿原酸、迷迭香酸、对羟基苯甲酸等有机酚酸类物质，只有对羟基苯甲酸没有检出。

6 氧化时间

国内外大量的科学研究证明，蜂胶对机体的诸多保健功效与其抗氧化活性有着密切的关系。因此，蜂胶的抗氧化活性特别受到研究者的关注和重视。农业部颁发的标准《无公害食品-蜂胶》（NY5136-2002）、商业部颁发的《蜂胶》（SB/T10096-92）《蜂蜡》（SB/T10190-93）以及国家质检总局颁布的《蜂胶》（GB/T24283-2009）均对氧化时间进行了规定，并提供了相应的检测方法。

7 其他方面

资料表明，还可以对蜂胶的灰分、酶活力、维生素、微量元素以及矿物质进行分析测定[21,28～31]。对于蜂胶浸提液，还应增加乙醇含量和比重[32]的检测，从而使蜂胶质量的控制更加全面。

8 有毒有害物质

在蜂胶质量评定中，不仅要对蜂胶的感官性状进行观察、对天然活性成分进行分析检测，还要把有毒物的残留如铅、砷、汞、镉等重金属污染和农药残留以及霉菌、致病菌等指标也应作为质量控制的重要指标。农业部颁发的标准《无公害食品-蜂胶》（NY5136-2002）对蜂胶中的微生物指标及检验方法、重金属指标及检验方法、农药残留指标及检验方法均进行了规范。国家质检总局颁发了GB/T23870-2009[33]，采用微波消解-石墨炉原子吸收分光光度法测定蜂胶中的铅。已有研究证明，利用固相萃取法处理样品，电子捕获-气相色谱法测定了蜂胶中17种有机氯杀虫剂，定量限在2.6～38.1µg/kg之间，平均回收率为62.6～109.6%，RSD%为0.8～9.4%，4,4′-DDE在很多种峰胶中被检出。