厚朴中厚朴酚及和厚朴酚提取工艺的优化研究

李 锐，陈中兰，肖 宏，林世和，曾庆源

（1.湖北省钟祥市人民医院，湖北 荆门 431900； 2.湖北省武汉市第一医院，湖北 武汉 430000；3.湖北省武汉市第三医院，湖北 武汉 430000）

厚兰荷贴剂为钟祥市人民医院经验方，主要由厚朴[1－2]、板蓝根、薄荷等药材组方，对口腔溃疡、牙周炎症等口腔疾病有良好的治疗效果。方中主药厚朴有较强的抗菌作用，其中所含厚朴酚、和厚朴酚是主要的抗菌成分[3－8]。为此，以厚朴酚、和厚朴酚的提取率为考察指标，采用正交试验设计对厚朴醇提工艺进行优选，为生产工艺参数的确定提供数据支撑。

1 仪器与试药

中药材粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；98－1－B型电子调温电热套（上海亚荣生化仪器厂）；Starsorius BSI型电子分析天平（d=0.01 mg，北京赛多利斯天平有限公司）；Dionex－Ulimate 3000型半制备高效液相色谱仪；紫外检测器。厚朴（批号为080511）购于湖北天济中药饮片有限公司，经湖北中医学院药学院中药鉴定教研室陈科力教授鉴定为木兰科植物厚朴 Magnolia offisenalis Rehd.etWils的干燥干皮；厚朴酚对照品（批号为110729－200310）及和厚朴酚对照品（批号为110730－200609）由中国药品生物制品检定所提供；乙醇为化学纯，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 厚朴提取物制备

分别精密称取厚朴饮片9份，每份100 g，按正交设计表安排的因素和水平进行加热回流提取，提取液过滤，滤液减压浓缩至相对密度1.10，加2％NaOH溶液调pH约为11，静置2h，过滤，滤液再加2％的盐酸溶液调pH约为2，静置24h，过滤，沉淀水洗至中性，50℃真空干燥，制得厚朴提取物。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Dionex－Acclaim.120 C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇－水（75∶25）；柱温：30℃；流速：1mL/min；检测波长：294 nm；进样量：10μL。色谱图见图1。

2.2.2 溶液制备

取厚朴提取物约0.1 g，精密称定，置10mL容量瓶中，加甲醇10mL溶解并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。精密称取厚朴酚对照品20.5mg、和厚朴酚对照品12.5mg，精密称定，加甲醇50mL，分别制成每1mL含厚朴酚410μg、和厚朴酚250μg的混合溶液，即得对照品溶液。

图1 高效液相色谱图

2.2.3 方法学考察

标准曲线制备：分别精密吸取厚朴酚与和厚朴酚对照品溶液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL，分别置10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述稀释液10μL，注入液相色谱仪，按拟订的色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制标准曲线，得回归方程，厚朴酚为 A=6772C+5 361（r=0.999 8），和厚朴酚为 A=11 648×105C－331 291 456（r=0.999 5）。结果表明，厚朴酚与和厚朴酚进样量分别在0.205～4.1μg和0.125～2.5μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

精密度试验：分别取厚朴酚、和厚朴酚对照品溶液各10μL，依法连续进样测定峰面积。结果厚朴酚与和厚朴酚的 RSD分别为0.79％和0.62％（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10，24，48h时测定峰面积。结果厚朴酚、和厚朴酚的 RSD分别为0.91％和1.13％（n=8），表明供试品溶液在48h内稳定性良好。

重复性试验：取同一批样品（批号为090311）6份，每份0.5 g，精密称定，依法制备供试品溶液，按拟订的色谱条件进样测定。结果样品中厚朴酚、和厚朴酚平均含量分别为5.822mg/g和5.189mg/g，RSD分别为1.60％和1.58％（n=6），表明方法重现性好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为090311）0.25 g共6份，分别精密加入对照品溶液适量，依法测定并计算回收率。结果见表1。

表1 厚朴酚与和厚朴酚加样回收试验结果（n=6）

2.2.4 样品含量测定

精密吸取供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，按拟订的色谱条件测定峰面积，根据回归方程求得厚朴酚与和厚朴酚的含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n=2）

2.3 提取工艺优选

2.3.1 正交设计试验及结果

在预试验的基础上，采用正交试验优化提取工艺。选取料液比（因素A）、乙醇体积分数（因素B）、提取时间（因素C）、提取次数（因素D）作为考察因素，各因素取3个水平，以L9（34）正交试验表安排试验，以厚朴酚与和厚朴酚得率之和为评价指标，用SPSS12.0统计软件进行数据处理，对评分结果作直观分析和方差分析，筛选最佳工艺条件。结果见表3－5。由方差分析结果可知，提取效果的影响因素大小顺序为液料比＞提取时间＞提取次数＞乙醇体积分数，液料比、提取时间对结果影响显著，提取次数、乙醇体积分数则影响不显著。根据直观分析，最佳提取条件为A2B2C3D3，但由于因素C和因素D第2水平、3水平结果差异很小，为节约工时并考虑到工业生产实际，决定选取第2水平。因此，优选的提取工艺为A2B2C2D2，即料液比为8，乙醇体积分数为70％，提取3次，每次提取时间为2h。

表3 正交试验因素水平表

表4 厚朴提取工艺正交试验结果表

表5 方差分析结果表

2.3.2 验证试验

为确定该工艺的优劣和稳定性，据优选的提取工艺，对同一批药材（取样量为100 g）进行3次试验。结果编号为071101，071102，071103的样品提取物中厚朴酚与和厚朴酚的总得率分别为2.75％，2.68％，2.78％，平均2.74％，RSD=1.88％（n=3）。可见，该提取工艺厚朴酚与和厚朴酚总得率高、重现性好、工艺稳定可行、实际操作简单，适合工业化生产。

3 讨论

厚朴的主要抗菌有效成分为厚朴酚、和厚朴酚，因此正交试验选取厚朴酚与和厚朴酚总得率为考察指标。关于厚朴中厚朴酚及和厚朴酚的含量测定方法很多，本研究采用的高效液相色谱法测定正交工艺提取制备的样品，具有较好的灵敏度和准确度。

厚朴中厚朴酚及和厚朴酚的提取工艺有冷浸法、煎煮法、超声法等，但本研究选用的乙醇提取法较以上提取法提取的提取液抑菌效果更佳，且所需设备简单、工艺稳定、提取效率较高、乙醇低毒、易回收、无污染。

本研究通过正交设计对厚朴酚及和厚朴酚的提取工艺进行优化，优选方法设计简单可行，符合我院实际应用。另外，优化的提取工艺验证试验结果符合预期，说明其有效、合理、稳定可行，适合于工业化大生产。

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