膀胱肿瘤细胞体外侵袭过程的扫描电镜观察

徐跃文，张超，桂俊卿，张小德，杨德林

0 引言

膀胱癌(carcinoma of urinary bladder，CUB)是泌尿生殖系中最常见的恶性肿瘤，近年来发病有增加趋势［1］。膀胱肿瘤的一非常重要的特性就是其具有空间上的多灶性和时间上的反复发作的特点［2－4］，侵袭是转移发生最初的一步，是转移性肿瘤必备的基本特性之一［5］。Matrigel穿膜侵袭实验是研究肿瘤细胞在体外侵袭能力的常用实验之一，经常使用Boyden小室体外侵袭实验检测肿瘤细胞的侵袭潜能。本实验运用扫描电子显微镜对侵袭中的肿瘤细胞进行观察，从形态学上对体外侵袭实验进行证实，并为进一步研究肿瘤细胞的侵袭提供条件，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料膀胱癌细胞BIU-87的体外高侵袭力亚系BIU-87-m3由本实验前期筛选，鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3购自中国科学院昆明动物研究所细胞室，RPMI-1640、胰蛋白酶购自美国GIBCO公司，PBS、胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司，2.5%戊二醛(电镜固定液)由电镜室提供，插入式培养皿(杯状结构，底由聚碳酸酯膜封闭，孔径为8 μm)购自millipore公司，Matrigel(大鼠ESH肉瘤细胞外基质提取物)购自BD公司，S-3000N扫描电子显微镜由日本日立公司生产。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养BIU-87-m3、NIH3T3细胞用含体积分数10%胎牛血清的1640培养基，于37℃、体积分数5%CO2、95%湿度的CO2孵箱中培养，2～3 d传代1次。

1.2.2 细胞侵袭参照Girnita等［6］方法，稍加改良。①趋化因子的制备(NIH3T3细胞条件培养基):NIH3T3细胞培养至90%融合时，无血清1640洗3遍，无血清1640常规培养24 h后收集培养液，500×g离心10 min，收集上清，－20℃冰箱保存备用;②构建侵袭小室:Matrigel用无血清1640按1∶8比例稀释，以每个插入式培养皿100 μg，均匀涂加于膜上，37℃成胶20 min，超净台内紫外线照射过夜(共制作6个)。使用前加无血清1640，CO2孵箱中37℃、30 min水化;③待筛细胞制备:BIU-87-m3细胞融合至90%时，常规消化，血细胞计数板计数，无血清1640洗3遍，调细胞浓度为1×104/ml;④细胞侵袭:取趋化因子，按0.6 ml/孔加入24孔板中。将制备好的侵袭小室放入24孔板。取待筛细胞，以0.2 ml(约2×103个细胞)每膜，加于膜上。常规侵袭7 h后，取出侵袭小室，电镜固定液(2.5%戊二醛)固定，送电镜室。

1.3 观察取出侵袭小室，尖刀片切下侵袭小室底的聚碳酸酯膜;随机取3个标本室腔面向上，另外3个底面向上，扫描电子显微镜下观察。

2 结果

2.1 室腔面观察铺有Matrigel的聚碳酸酯膜上可以观察到聚碳酸酯膜上的孔径为8 μm小孔被Matrigel封闭;膀胱癌细胞BIU-87-m3的体积比较大，呈椭圆形，表面有微绒毛，贴在Matrigel上生长;一个或多个细胞伸出伪足固定在Matrigel上，并向聚碳酸酯膜上的小孔伸出伪足，正在穿过Matrigel及聚碳酸酯膜上的小孔(图1)。

2.2 背面观察可见到已经穿过侵袭膜贴附于侵袭膜背面的肿瘤细胞(图2a);肿瘤细胞伸出伪足并穿过侵袭膜上的小孔贴附于膜背面(图2b)。

图1 侵袭膜室腔面扫描电镜观察Figure 1 Cavosurface of the constructed membrane under the scanning electron microscope

图2 侵袭膜背面扫描电镜观察Figure 2 Dorsal surface of the constructed membrane under the scanning electron microscope

3 讨论

肿瘤细胞的基本特性之一就是其不受控制，而且特有侵入周边组织和转移的能力，肿瘤细胞这一特性是导致肿瘤难以治愈的重要原因［7］。这一特性在恶性肿瘤细胞穿过血管组织，并通过血液扩散最终导致肿瘤转移的过程中尤为关键［8］。1992年Stetler-Stevenson等［9］提出肿瘤穿透细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的三步理论:肿瘤细胞借助于表面的受体和ECM上的黏附分子，与ECM发生特异性结合;通过一系列蛋白水解作用，降解ECM形成小孔隙;借助于细胞的收缩和移动成份，肿瘤细胞进入新的定植区。罗刚等［10］证实黏附蛋白MUC1/Y在膀胱肿瘤细胞中表达，并能够改变肿瘤细胞黏附特性。

最近Makale［11］对肿瘤细胞的机械运动与肿瘤的侵袭转移进行了综述，指出细胞骨架上的许多分子可以通过细胞外ECM被激活，进而引起细胞运动。Wai和Kuo［12］认为骨桥蛋白在细胞的运动中起到非常重要的作用，并且认为骨桥蛋白可以成为治疗侵袭性疾病的潜在靶点。伍庄等［13］通过使膀胱肿瘤细胞BIU-87表达CH50多肽使肿瘤细胞黏附力降低，而增加其灌注化疗的效果。

传统体外侵袭实验的基础即是在该理论的基础上进行设计，简单介绍如下:以聚碳酸酯膜为支撑物，并在该膜上制成小于侵袭细胞的小孔(通常为8～12 μm);将人工基膜胶(ECM类似物)铺在该膜上封闭小孔，在膜的下方给予趋化因子，以促进细胞定向移动，通过计数侵袭膜背面的细胞数来对比不同细胞的侵袭能力。因此，如果该细胞能穿透构建的侵袭膜，则该细胞就具有黏附于人工基膜胶(ECM类似物)的能力，并且具有溶解人工基膜胶和变形运动的能力。沈健等［14］扫描电镜观察了食管癌细胞SHFFC1可以生长在羊膜正而(上皮细胞面)和背而(纤维面)，其锚锭时间24～48 h。可见丝状伪足伸出固定在支持物上。

作者在实验中发现，测定侵袭力的侵袭试验单纯计数膜背面的细胞是不够准确的，因为有一部分细胞不仅穿过了Matrigel和聚碳酸酯膜，且掉到了24孔板中，而这部分细胞是未被检测的，因此，测定侵袭力时在计数膜背面细胞的同时应计数掉入24孔板中的细胞数。

通过扫描电镜对肿瘤侵袭的过程进行观察，发现肿瘤细胞侵袭的过程是在趋化因子的作用下的连续的溶解基质和变形运动的过程。细胞要“有效”的运动，首先要确定哪里是“前方”，否则会出现细胞体两部分同时向相反方向运动的情况(这在一些神经系统不发达的无脊椎动物中是可以见到的)。而这个确定方向的过程，其实是细胞内与运动有关的物质，如钙离子、肌球蛋白和各类细胞骨架物质的浓度重新分布的过程，因此，细胞显出“极性”，这个重新分布的过程也因而被称为细胞“极化”(Polarization)。细胞可以靠其表面的受体顺着诱饵的浓度“嗅”到其发放的源头，或者“感受到”底质上的“路标”而确定自身去向，前者被称为细胞的化学趋向性。

因此，该实验为进一步通过干扰膀胱肿瘤细胞的侵袭，为预防和治疗膀胱癌的复发提供新的思路和方法。研究与侵袭和微环境直接相关的因素［15］，而不是只重视增殖、肿瘤大小、数目等非直接相关因素，才是认识并最终防治侵袭转移的正确途径。

［1］顾方六，刘玉立.50年泌尿男生殖系肿瘤发病和构成情况变迁［J］.中华泌尿外科杂志，2002，23(2):88-90.

［2］Mohammed A，Khan Z，Zamora I，et al.Biological markers in the diagnosis of recurrent bladder cancer:an overview［J］.Expert Rev Mol Diagn，2008，8(1):63-72.

［3］曾铮，周晓军.膀胱癌分子标记物［J］.医学研究生学报，2009，22(12):1333-1336.

［4］程文，高建平，张征宇，等.Ⅱ级膀胱尿路上皮癌mincroRNA差异表达及意义［J］.医学研究生学报，2010，23(1):48-52.

［5］Chambers AF，Macdonald IC，Schmidt EE.Steps in tumor metastasis new concepts from intravital videomicroscopy［J］.Cancer Metastasis Rev，1995，14(4):279-301.

［6］Girnita A，All-Ericsson C，Economou MA，et al.The insulin-like growth factor-Ⅰreceptor inhibitor picropodophyllin causes tumor regression and attenuates mechanisms involved in invasion of uveal melanoma cells［J］.Clin Cancer Res，2006，12(4):1383-1391.

［7］Quaranta V，Giannelli G.Cancer invasion:watch your neighbourhood［J］.Tumori，2003，89(4):343-348.

［8］宋波，金锡御.恶性肿瘤侵袭三步曲-黏附-蛋白水解-游走［J］.国外医学泌尿系统分册，1996，16(2):15－87.

［9］Stetler-Stevenson WG，Kiotta LA，Klieiner DE.Extracellular matrix 6:Role of matrix metalloproteinases in tumor invasion and metastasis［J］.FASEB J，1993，7(15):1434-1441.

［10］罗刚，周四维，曹正国，等.黏附蛋白MUC1/Y在膀胱肿瘤细胞中表达及意义［J］.医学研究生学报，2005，18(4):292-294.

［11］Makale M.Cellular mechanobiology and cancer metastasis［J］.Birth Defects Res C Embryo Today，2007，81(4):329-343.

［12］Wai PY，Kuo PC.Osteopontin:regulation in tumor metastasis［J］.Cancer Metastasis Rev，2008，27(1):103-118.

［13］伍庄，陈忠，叶章群，等.CH50多肽在膀胱肿瘤细胞系BIU-87中的表达和鉴定［J］.医学研究生学报，2005，18(4):306-308，311.

［14］沈健，陈铭华，郑瑞明，等.肿瘤细胞侵袭性体外检测的扫描电镜观察［J］.电子显微学报，2000，19(3):313-314.

［15］徐锋，苏筠，程文，等.RNA干扰hTR基因对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性的影响［J］.医学研究生学报，2009，22(6):587-591.