兔角膜上皮细胞体外原代培养和鉴定

王 丹，李 彦，孙桂媛，汪 卓

（1.中国医科大学基础医学院组织胚胎学教研室，辽宁沈阳 110001；2.沈阳药科大学生命科学与生物制药学院药理学实验教学中心，辽宁沈阳 110016；3.何氏医学院药理学教研室，辽宁沈阳 110163）

·论 著·

兔角膜上皮细胞体外原代培养和鉴定

王 丹1，3，李 彦2，孙桂媛1*，汪 卓3*

（1.中国医科大学基础医学院组织胚胎学教研室，辽宁沈阳 110001；2.沈阳药科大学生命科学与生物制药学院药理学实验教学中心，辽宁沈阳 110016；3.何氏医学院药理学教研室，辽宁沈阳 110163）

目的建立体外原代培养兔角膜上皮细胞简单经济实用的方法，并观察其体外生长的生物学特性。方法采用全角膜组织培养法培养兔角膜上皮细胞并进行传代培养，通过形态学观察并应用免疫组织化学方法对细胞进行鉴定。结果兔角膜上皮原代培养第2天，组织边缘有细胞游出，细胞和细胞核均呈圆形，胞核位于细胞中央或旁中央区；第3天，细胞呈扁平多边形，相互连接成片；兔角膜上皮原代培养第7天，局部可见悬浮细胞生长；兔角膜上皮细胞培养第2代第2天，细胞生长旺盛，部分细胞贴壁呈片状多边形。兔角膜细胞免疫组织化学显示广谱角蛋白单克隆抗体阳性。结论全角膜培养角膜上皮细胞简单实用，可获得状态良好的连续传代扩增的细胞。

角膜；上皮细胞；细胞培养技术；兔

角膜细胞成分培养是现代角膜病研究和治疗的基础，近年来，随着研究深入，对角膜细胞成分培养提出了更高要求。以往的培养方法复杂，对细胞损伤较大，导致活力降低，为此我们改良了体外原代培养兔角膜上皮细胞的方法，以建立一种简单、经济、实用的兔角膜上皮细胞培养方法，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：健康新西兰白兔6只，雌雄不限，体质量2.0～2.5kg。眼部经裂隙灯显微镜检查显示屈光间质透明，无眼前节病变。

1.1.2 主要试剂和仪器：DMEM/F12（Gibco，USA），胎牛血清（美国GIBCO），CO2培养箱（Hea1 ForceHF121UV），倒置相差显微镜（OLYMPUS CKX41，Japan），广谱角蛋白单克隆抗体PCK（BOSTER公司）。

1.1.3 培养液的制备：采用DMEM/F12、10%胎牛血清、100×103U/L青霉素和100×103U/L链霉素，pH值7.2～7.4。

1.2 实验方法

1.2.1 取材：取新西兰白兔6只，以空气栓塞法处死，无菌条件下迅速摘取12只眼球，用含有160× 103U庆大霉素的生理盐水冲洗3～5次，备用。

1.2.2 原代培养兔角膜上皮细胞：在超净工作台上将眼球用含有庆大霉素的PBS冲洗3次，沿角膜缘取下完整角膜，用注射器轻划角膜上皮表面，然后将角膜上皮面朝向培养皿铺平，将培养皿置于37℃培养箱中，20 min后取出，加入培养基，培养基液面与角膜平齐。置37℃、5%CO2和95%空气培养箱中培养，第2天补加少许培养液，3d后将角膜移至新培养皿中，再次贴与培养皿，置于培养箱20min后，再加入少许培养基，以获得新的上皮细胞。每个角膜可以移3～4次。以后每周换液2～3次，每次换半液。

1.2.3 角膜上皮细胞的传代：原代培养至上皮细胞80%融合后用PBS冲洗2次，加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 1mL冲洗1次，再加入消化液1～2 mL，倒置显微镜下观察细胞形态，待细胞变圆，细胞间隙变大或少量细胞脱壁时加入含血清的培养液终止消化，收集细胞悬液，离心6～8min（1 000r/min），计数，接种于培养瓶中（按1∶2或1∶3传代），3d后首次换液，以后每周更换2～3次，直至细胞完全融合。

1.2.4 免疫组织化学染色：兔角膜细胞培养在24孔板中，待细胞贴壁，移去角膜，吸出培养基，用多聚甲醛固定15min，用PBS浸泡3次，每次5min。加体积分数为95%乙醇溶液于玻片上，置室温下处理20min后用PBS浸泡3次，每次5min，室温下自然风干。采用免疫组织化学ABC法染色，加入体积分数为3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，在室温下放置10min，PBS浸泡3次，每次5min。加入胎牛血清封闭，常温下孵育10min，吸除多余血清；加入适当浓度的PCK单克隆抗体，置于4℃过夜后吸去多余的液体，再用PBS浸泡3次，每次5min。加入适当浓度的二抗IgG，室温下放置1h后吸去多余的液体，用PBS浸泡3次，每次5min。DAB显色，显微镜下观察显色情况，加入双蒸水终止，显微镜检查并照像。

2 结 果

2.1 培养细胞的形态学观察：兔角膜上皮原代培养第2天，组织边缘有细胞游出，细胞和细胞核均呈圆形，核位于细胞中央或旁中央区（图1）；第3天，细胞呈扁平多边形，相互连接成片（图2）；第7天，局部可见悬浮细胞生长（图3）；兔角膜上皮细胞第2代培养第2天，细胞生长旺盛，部分细胞贴壁呈片状多边形（图4）。

2.2 兔角膜上皮细胞的鉴定：兔角膜上皮细胞培养3d，呈不规则多边形生长。免疫组织化学染色显示兔角膜上皮细胞对广谱角蛋白单克隆抗体PCK免疫反应较强，胞浆染色阳性（图5）。

3 讨 论

自20世纪50年代细胞培养技术兴起以来，角膜细胞的培养在国内外已有不少报道，且培养技术一直不断改进［1-2］。有关眼表疾病的临床前与临床研究日益增多［3-4］，但以往关于角膜细胞的培养技术存在方法复杂（如单层培养法）和培养条件昂贵（如需要在培养液中加入特殊生长因子）等问题。因此，寻求一种取材简单、经济实用的培养方法，对眼表疾病、角膜病的基础研究具有重要意义。

消化法是培养角膜上皮细胞的一种常见方法，操作过程简便、培养周期短，但消化液的浓度及消化时间不易掌握，细胞活力易受到影响。研究［5］发现，分别使用消化培养法和组织块培养法培养小鼠角膜上皮细胞，其中80%组织块培养法的原代培养可成功传代，而仅12%消化培养法原代培养可成功传代；两者差异有统计学意义。传代培养中，组织块培养法中55%P1细胞可以传代超过P10并继续稳定传代至少可传至P25。而消化培养法传代至P2即不能融合，认为小鼠角膜上皮细胞的培养，组织块培养法优于消化培养法。本实验采用全角膜片培养由组织块培养法衍生而来不需添加其他试剂，实验操作时间短，能够很好地保持细胞活力，而且整个角膜片多次重复贴壁，能更大程度地增加获得的上皮细胞数量。

组织块贴壁法是一种较为传统的培养方法，存在着方法复杂、细胞生长缓慢、周期长、细胞成分不单一等问题。也有研究采用全角膜培养法［6］培养上皮细胞，运用机械刮除和差速贴壁相结合的方法进行兔角膜上皮细胞的纯化。本实验采用全角膜培养，为了使角膜上皮细胞更好地游出和贴壁，用针头轻划角膜上皮，操作简单，且不易混有成纤维细胞，能更好地减少对组织的损伤。在细胞原代培养和传代的培养中，本研究中上皮细胞的形态和鉴定结果与文献报道一致［6］。

我们认为本实验可以用于对角膜细胞的离体实验，可以为角膜离体疾病模型和角膜有关药物研发提供研究对象。（本文图见封二）

［1］KAUR H，CHAURASIA SS，AGRAWAL V，et a1.Expression of PDGF receptor-αin cornea1 myofibrob1asts in situ［J］. Experimenta1Eye Research，2009，89（3）：432-434.

［2］屈雷，敬晓棋，闫海龙，等.胎儿角膜上皮细胞分离方法的研究［J］.国际眼科杂志，2009，9（2）：250-253.

［3］AMBROSIORJR，KARA-JOSE N，WILSON SE.Ear1y keratocyte apoptosis after epithe1ia1 scrape injury in the human cornea［J］. Experimenta1Eye Research，2009，89（4）：597-599.

［4］MA P，WANG Z，PFLUGFELDER SC，et a1.To11-1ike receptors mediate induction of peptidog1ycan recognition proteins in human cornea1epithe1ia1 ce11s［J］.Experimenta1Eye Research，2010，90（1）：130-136.

［5］马小力，刘汉强.小鼠角膜上皮细胞消化培养法和组织块培养法的比较研究［J］.国际眼科杂志，2011，11（6）：939-942.

［6］石妍，杨帆，葛红岩，等.改良兔角膜上皮细胞原代培养及纯化的方法［J］.眼科新进展，2010，30（7）：612-615.

（本文编辑：赵丽洁）

CULTURE OF RABBIT PRIMARY CORNEAL EPITHELIAL CELLS

WANG Dan1，3，LIYan2，SUN Guiyuan1*，WANG Zhuo3*
（1.Department of Histology and Embryology，the College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Experimental Teaching Center of Pharmacology，the School of Life Scienceand Biopharmaceutics，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China；3.Department of Pharmacology，HE's University，Shenyang 110163，China）

ObjectiveTo estab1ish a convenient，economic and pragmatic method for rabbit corhea1 epithe1ia1 ce11s primary cu1ture，and observe the bio1ogic characteristics of growth in vitro.MethodsThe rabbit cornea1 epithe1ia1 ce11s were cu1tured by the entire cornea1 tissue-cu1ture.The morpho1ogica1 characteristics of cu1tured ce11s were observed by inverted phase contrast microscope at various time periods respective1y and the cu1tured ce11swere identified by immunohistochemica1method.ResultsThe rabbit entire cornea adhered in 2 days，the ce11s cou1d be seen c1imbing out from the cornea11imbus.The ce11s and nuc1eiwere spherica1and nuc1eiwere 1ocated next to the centra1area or in the center；The epithe1ia1ce11s were f1at and po1ygona1and connected to each other into membrane in 3 days；Suspension of ce11growth can be seen 1oca11y in 7 days of primary cu1ture；The cornea1epithe1ia1 ce11s grew vigorous1y and some ce11swere adhered and were f1aky and po1ygona1on day 2 of passage 2. The cu1tured ce11s stained positive1y for monoc1ona1 antibody pan cytokeratin by immunohistochemica1 method.ConclusionThe entire cornea1 tissue-cu1ture is a simp1e convenient and practicab1e method for cu1turing cornea1epithe1ia1ce11swhich cou1d be seria11y subcu1tivated.

cornea；epithe1ia1ce11s；ce11cu1ture techniques；rabbit

Q813.11

A

1007-3205（2011）10-1117-03

2011-07-09；

2011-09-03

王丹（1974-），女，辽宁昌图人，中国医科大学基础医学院医学博士研究生，从事神经退行性相关疾病研究。

1*通讯作者。E-mai1：sungy2004@sohu.com

3*通讯作者。E-mai1：1uckzhuo1982@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2011.10.001