NASBA技术及其在畜禽病毒检测中的应用*

张荣升,鄢明华,张国伟,张 莉

(1.天津农学院,天津 300384;2.天津市畜牧兽医研究所,天津 300112)

NASBA技术及其在畜禽病毒检测中的应用*

张荣升1,2,鄢明华1*,张国伟1,张 莉1

(1.天津农学院,天津 300384;2.天津市畜牧兽医研究所,天津 300112)

NASBA即核酸序列依赖扩增技术,主要用于扩增RNA,是由一对特异性的引物介导的、连续均一的、体外核酸序列等温扩增反应过程。该技术具有操作简便,特异性强,敏感性高,快速,高通量等优点,目前已经广泛应用于人类与动物的多种病毒性疾病的检测,具有良好的应用前景。在禽流感病毒、新城疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒、口蹄疫病毒等的检测中均表现出了很高的敏感性和特异性。论文简要介绍了NASBA技术的原理,特点以及在畜禽病毒检测中的应用,旨为病毒检测技术提供新的途径。

NASBA;原理;病毒检测

当前,畜禽病毒性疾病盛行,病毒变异在加速,而且普遍存在几种病毒的混合感染,给畜禽养殖业带来了巨大的损失[1]。因此,针对病毒性的传染病,需要快速,准确,简便的诊断方法,以便在第一时间内迅速的判断出疾病病原,采取有效的控制措施,最大限度的降低损失。快速、准确、定期的对畜禽群体健康状况和养殖环境进行监测可以防患于未然,为养殖业保驾护航。NASBA(nucleic acid sequencebased amplification)技术于1991年由Compton J报道[2],是在PCR基础上发展起来的一项新的核酸扩增技术。在42℃条件下2 h左右可将模板RNA扩增约l09～1012倍。其特点是操作简单,不需要特殊仪器,不需要温度循环,整个反应过程由3种酶控制,循环次数少,忠实性高。基于这些优点,在兽医领域,已经应用于禽流感[22]、新城疫[23]、蓝耳病[5]、传染性胃肠炎[24]等疾病的诊断和检测,这一技术在兽医传染病监测和诊断方面具有良好的应用前景。

1 NASBA扩增反应原理

NASBA扩增反应技术是由一对特异性的引物引导的等温条件下的核苷酸序列的体外扩增,该反应由3种酶控制完成:禽源成髓细胞瘤逆转录酶、RNA酶H和T7RNA聚合酶。反应体系除了以上3种酶外还包括:核糖核苷三磷酸、脱氧核糖核苷三磷酸、一对特殊引物及各种缓冲液等。引物P1的5′末端含有能被 T7 RNA聚合酶识别的启动子序列[4]。

整个反应分为两相:在非循环相,引物P1与模板RNA退火,在AMV逆转录酶作用下形成RNA:DNA杂交链,RNaseH随后水解掉杂交链上的RNA链,留下一条单链DNA。引物P2随后与这条DNA链的5′末端退火,AMV逆转录酶催化合成第二条DNA链。T7RNA聚合酶识别双链DNA中的启动子区,催化DNA转录为RNA,由每一分子模板可产生100拷贝的RNA。新合成的RNA进人循环相,成为反转录的模板。他们首先与引物P2结合,由AMV逆转录酶催化合成一条DNA链,形成RNA:DNA杂交分子,RNaseH水解RNA,留下一条单链DNA,引物P1退火,逆转录酶再催化合成一条新的含有T7RNA聚合酶启动子的DNA片段,T7RNA聚合酶再以此DNA为模板合成更多拷贝的RNA,如此循环反复,使RNA拷贝数被不断放大。该技术尤其适合于单链RNA的扩增。

2 NASBA扩增反应步骤

2.1 RNA的提取

NASBA方法中的RNA提取可以采用试剂盒或者常规RNA提取的方法,主要经过T rizol裂解细胞,氯仿抽提,异丙醇沉淀,乙醇洗涤这几个步骤,操作过程中的耗材均要经过DEPC水的处理,防止RNA酶降解所提取的RNA。

2.2 RNA的NASBA法扩增

将提取的RNA加到标准的NASBA反应体系中,先在65℃水浴5 min以破坏RNA的二级结构,然后42℃条件下水浴5 min使引物与模板退火。5 min后迅速加入酶混合液开始扩增反应,42℃水浴,孵育2 h后转入-20℃终止反应[5]。

3 NASBA扩增产物检测

3.1 电化学发光检测法

目前使用最多的定量检测NASBA产物的方法为电化学发光检测法(electrochemiluminescence,ECL)[6-9]。该方法需要两个与NASBA产物互补的寡核苷酸探针,分别是捕获探针和检测探针。检测探针标记有电化学光信号,捕获探针携带生物素。二者与NASBA产物在杂交液中产生杂交复合物。此过程中该复合物被磁珠捕获到电极处,TAG也被吸附到电极表面,低电压作用下钌离子发生氧化-还原反应产生光子,经过ECL阅读器将光信号输出可对RNA定量分析。这种检测方法具有快速、敏感、不需要后期处理等优点,如果在操作的过程当中同时使用参照物,可以检测到反应初始的RNA数量。但是在使用的过程当中需要ECL阅读器等特殊仪器,不便于基层的使用。

3.2 荧光检测法

分子信标技术(NASBA-beacon)是将NASBA技术和实时分子灯塔技术相结合,具有更加方便、快捷、敏感、不易被污染等优点。分子灯塔是具有“发夹”样结构的单链寡核苷酸探针,一般为含20～30个核苷酸,其中环状序列是与目标链互补的探针。当无靶序列存在时,茎部的2条核苷酸链互补,末端分别与荧光素(5′端)和淬火物质(3′端)结合,茎部的双链互补结构使末端的荧光素和淬火物质紧靠在一起,因荧光素共振能量转移作用而使荧光被吸收,这样荧光素就不能发光,此时便检测不到荧光信号;当有靶序列存在时,分子信标的环序列与靶序列特异性结合,随着环状序列打开,茎部的双链结构也打开,荧光素共振能量转移作用不能得到发挥,荧光素和淬火物质分离使得此时能够检测到荧光。荧光检测技术与NASBA技术都是在低温条件下反应,所以这两项技术可以完美的结合。该检测方法操作简单且省时,可以自动化操作,减少了携带污染,适合于分析高通量样本[10-11]。

3.3 酶联检测法

3.3.1 酶联凝胶试验 酶联凝胶试验(enzymelinked gel assay,ELGA)即用5′端标记了辣根过氧化物酶的寡核苷酸探针与NASBA产物作用,然后聚丙烯酰胺凝胶电泳将杂交复合物和未杂交的探针分离,过剩的未杂交探针便从杂交产物中析出,底物液孵育后显色观察。该方法通过探针上标记物的的信号放大作用而检测到目的片段,是一种快速、非放射性的方法[5]。

3.3.2 NASBA-酶联寡核苷酸捕获法 NASBA-酶联寡核苷酸捕获法(NASBA-enzyme-linked oligonucleotide capture,NASBA-EOC)即应用 ELISA检测系统,生物素标记的捕获探针吸附于包被有链霉亲和素的微孔板,而标记地高辛的检测探针与扩增产物互补,在杂交缓冲液进行NASBA反应,然后加入酶联抗地高辛抗体,经显色后在分光光度计中405 nm的波长下读取吸光值检测所产生的比色信号便可进行结果判定[12-13]。

3.4 核酸杂交检测法

核酸杂交检测法(in situ hybridization-NASBA,IS-NASBA)是运用ISH杂交技术,用经过标记的ISH探针与扩增产物RNA杂交,洗脱掉没有结合的ISH标记探针,通过紫外分光光度计来检测与RNA相结合的ISH标记探针量,从而对扩增产物RNA作定量分析。IS-NASBA技术比IS-PCR具有更高的敏感性和扩增效率,操作简单方便[14]。

4 NASBA反应特点

4.1 特异性强

由于上游引物P1的5′端含有T7RNA聚合酶启动子序列,外来双链DNA便不可能被扩增,这就显著提高了NASBA反应的特异性。另外,由于反应不需高温变性步骤,所以 NASBA不会受到双链DNA的污染。

4.2 灵敏度高

较高的扩增效率决定了该方法的高灵敏度,NASBA反应2 h左右可将模板RNA扩增约109～1012倍,合成的 RNA 量达1.3 μ g。一个 RNA 模板能够产生大约100个拷贝。比起PCR技术,该技术能用较少的循环便扩增出大量的目的基因,保证了NASBA的高敏感性[7]。

4.3 保真度高

与PCR的产物DNA分子不同,NASBA法的产物RNA分子不易对实验仪器和环境造成污染,避免了产物交叉污染引起的假阳性结果。而且由于NASBA的高效性缩短了反应时间,从而降低了酶促反应过程中的核苷酸错配机率,因此转录更加忠实于模板。

4.4 操作简便

NASBA具有扩增效率高,特异性强,高通量,需要的病料数量少等优点,较易实现自动化。此外,该方法为等温扩增,使用的过程当中不需要PCR仪等特殊的设备,只使用恒温水浴锅就可以完成整个扩增反应过程,更适合基层实验室使用,可应用于动物口岸和产地检疫、养殖场环境监测、畜禽群体健康状况检测和疾病诊断等[18]。

5 NASBA技术在畜禽病毒检测中的应用

目前,NASBA技术在国内外已经成功的应用于多种病毒的检测,但主要集中在人类疾病领域,如人的艾滋病病毒(HIV)[15-17]、甲型肝炎病毒(HAV)[19]、丙型肝炎病毒(HCV)[20]、狂犬病病毒(RV)[21]。在兽医领域的研究,已有应用于禽流感(AI),新城疫(ND),蓝耳病(PRRS),传染性胃肠炎(TGE),口蹄疫(FMD)等疾病的诊断和检测研究的报道。与目前商品化的免疫检测试剂盒相比,NASBA技术至少敏感1 000倍,比常规PCR方法也敏感许多,与现行的病毒培养检测方法的灵敏度相当,因此,该方法已经引起许多研究者的关注。

5.1 NASBA法检测禽流感病毒

单松华等[22]对H5亚型禽流感病毒HA基因序列进行分析,设计并筛选了最佳引物,采用优化的NASBA方法对禽流感病毒进行特异性和敏感性实验。结果仅检测到了禽流感病毒H5亚型,其他20个已知病毒样品皆为阴性,表明该方法的特异性强。采用已知禽流感病毒A/Chicken/HK/1000/97(H5N1)的鸡胚尿囊液(ELD5010-7.5/mL),经10倍连续稀释,用病原分离法和NASBA法进行比较,二种方法的灵敏度相当。用A/Chicken/HK/1000/97(H5N1)病毒人工感染SPF鸡、商品鸡,采用NASBA法和病原分离法同时对人工感染鸡的粪拭子、血液进行了动态检测,共检测了101个组织脏器,两种方法的符合率为 90%(87/97),表明该方法敏感性高。

5.2 NASBA法检测新城疫病毒

Cui S J等[23]针对新城疫病毒的融合蛋白基因(F基因)保守片段设计引物,应用NASBA技术检测了7个血清型的72份新城疫病毒,10-8稀释度仍能检测到病毒存在,比传统的病毒培养敏感度高10倍。特异性较好,与人A型流感病毒和H5亚型禽流感病毒无交叉反应。由于新城疫的传染性强,对鸡群危害十分严重,早期诊断和鸡场环境监测显得尤为重要。该方法有着检测准确,灵敏,操作简便,检测时间短等优点,对于新城疫的快速诊断和检测具有重要的意义。

5.3 NASBA法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒

梁海霞等[5]针对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF1中编码非结构蛋白Nsp 2的基因序列设计引物,建立了核酸序列依赖性扩增(NASBA)方法,并结合ELISA技术建立了NASBA-ELISA方法用来检测高致病性 PRRSV。采用建立的 NASBAELISA可检测到 101.83TCID50/mL的 Hu N4株PRRSV。结果表明,NASBA-ELISA能够敏感并特异地检测高致病性PRRSV,而对经典株PRRSV和其他猪源病毒的检测结果均为阴性,体现了该方法的高敏感性和高特异性。

5.4 NASBA法检测猪传染性胃肠炎病毒

李小兰等[24]建立了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的 NASBA检测方法,该研究利用猪TGEV的 S基因保守序列设计引物,建立了扩增TGEV的NASBA检测技术。对 TGEV进行扩增获得约 200 bp特异性目的条带,而对 CSFV、PRRSV、PCV-2、PPV、PEDV 和ST细胞扩增结果均为阴性。该研究利用病毒分离法、RT-PCR法和建立的NASBA方法对86份临床样品进行检测,结果显示NASBA最低病毒检出量为5 pg,RT-PCR与NASBA的符合率为84.9%,病毒分离法与NASBA的符合率为98.8%,表明NASBA法的敏感性与病毒分离法相当,但病毒分离法操作费时,实验条件要求高。NASBA的灵敏度高于普通 RTPCR,与病毒分离方法相当,可检测到5 pg的核酸,而RT-PCR的检出量为100 pg,为TGEV的早期诊断提供了新途径。

5.5 NASBA法检测猪口蹄疫病毒

Lau L T等[12]针对口蹄疫病毒(FMDV)基因组5′非转译区(5′UT R)高保守性 IRES序列设计通用引物,用NASBA法可以检测到7个血清型的FMDV。对 200份 FMDV样品,以 NASBA-ECL和NASBA-EOC方法检测扩增产物,NASBA-ECL的敏感性为 92.9%,NASBA-EOC的敏感性为 97.1%,均高于常规的RT-PCR。高特异性和高敏感性以及相对简单的操作性使得该方法对于口蹄疫的快速检测具有很好的应用前景。

6 展望

传统的检测方法已经不能准确的诊断病原,运用分子生物学手段检测病原已经成为一种趋势。目前,应用范围最为广泛的诊断方法为PCR,能够较为准确检测畜禽病毒性疾病。而NASBA技术具有特异性强、灵敏度高、反应迅速、操作简单等特点,特异性和灵敏性均高于 PCR,当发生疫情时能够及时、准确地检测病毒感染的情况,以及时采取有效措施控制疾病的蔓延。另外,利用该技术的高度灵敏性和特异性可以用于疾病流行情况和养殖环境监测,防患于未然,降低不必要的恐慌和损失。该技术在兽医领域具有良好的发展前景及广阔的应用前景。

[1]丁 铲.病毒的进化与传播[J].中国动物传染病学报,2010,18(4):71-75.

[2]Compton J.Nucleic acid sequence-based amplification[J].Nature,1991,350:91-92.

[3]马保华,李 贺,吕 平,等.依赖核酸序列的扩增技术在动物病原微生物检测中的应用[J].动物医学进展,2007,28(4):110-112.

[4]Souza D H,Jaykus L A.Nucleic acid sequence based amplification for the rapid and sensitive detection ofSalmonella entericafrom foods[J].App Microbiol,2003,95(6):1343-1350.

[5]梁海霞,薛青红,高金源,等.高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒NASBA-ELISA检测方法的建立[J].中国兽医科学,2009,39(05):401-404.

[6]赵志权,王福广,郝环颍,等.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的 RT-PCR鉴别诊断方法[J].华南农业大学学报,2008,29(3):68-78.

[7]高闪电,常惠芸,丛国正,等.NASBA(依赖核酸序列的扩增)技术及其在病毒检测中的应用[J].中国生物工程杂志,2009,29(1):80-85.

[8]寇晓霞,吴清平,范宏英.轮状病毒NASBA检测研究[J].微生物学报,2006,46(2):328-330.

[9]Costa A,Lamb D,Garland S M,et al.Evaluation of light cycler as a platform for nucleic acid sequence-based amplification(NASBA)in real-time detection of enteroviruses[J].Curr Microbiol,2008,56:80-83.

[10]Weusten J J A M,Carpay W M,T om A M,et al.Principles of quantitation of viral loads using nucleic acid sequence-based amplification in combination with homogenous detection using molecular beacons[J].Nucleic Acid Res,2002,30,e26

[11]王 虹,陈金华,曾位森,等.NASBA荧光分子信标技术定量检测丙型肝炎病毒[J].中国生物工程杂志,2003,23(12):111-113.

[12]Lau L T,ScottM R,Donald P K .Detection of foot and mouth disease virus by nucleic acid sequence-based amplification(NASBA)[J].Vet Microbiol,2008,126(1-3):101-110.

[13]孔令青,李 勇,高 洪,等.生物素亲和素标记技术[J].动物医学进展,2008,29(4):100-102.

[14]秦维超.NASBA和 IS-NASBA的临床应用及研究进展[J].国际检验医学杂志,2006,27(2):158-160.

[15]Uyttendaele M,Sehukkink R,Gemen B,et al.Development of NASBA,a nucleic acid amplification system,or identification of Listeria monocytogenes and comparison to ELISA and a modified FDA method[J].Food Microbiol,1995,27(1):77-89.

[16]Samuelson A,Westmoreland D,Eccles R,et al.Development and application of a new method for amplification and detection of human rhinovirus RNA[J].Virol Methods,1998,71(2):197-209.

[17]马义才,陈李容,Alison Cox.661份 HIV抗体阳性血浆标本HIV-1 RNA浓度测定[J].中国输血杂志,2003,16:312-313.

[18]Deiman B,Aarle P V,Sillekens P.Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification(NASBA)[J].Mol Biotechnol,2002,20(2):163-179.

[19]颜 进,刘剑雄,彭红梅.NASBA(核酸序列依赖的扩增)及其在医学上的应用[J].国外医学:临床生物化学与检验学分册,1997,18:66-69.

[20]骆利敏,黄建生,李 明,等.应用 NASBA定量检测 HCV RNA的研究进展[J].Tropical Medicine,2002,52(1):64-66.

[21]Wacharapluesadee S,Hemachudha T.Nucleic-acid sequencebased amplification in the rapid diagnosis of rabies[J].Lancet,2001,358(9285):892-893.

[22]单松华,刘乐庭,陈家华,等.NASBA快速检测禽流感 H5亚型病毒[J].中国病毒学,2005,20(3):288-292.

[23]Cui S J,Fung Y W,Lau L T,et al.Detection of newcastle disease virus using nucleic acid sequence-based amplification[J].Biologicals,2007,35(1):13-18.

[24]李小兰,聂福平,李应国,等.猪传染性胃肠炎病毒NASBA检测方法的建立[J].中国预防兽医学报,2010,32(6):451-454.

NASBA Technology and Its Application in Detection of Livestock Viruses

ZHANG Rong-sheng1,2,YAN Ming-hua1,ZHANG Guo-wei1,ZHANG Li1

(1.Tianjin Agricultural University,T ianj in,300384,China;2.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine,Tianjin,300112)

Nucleic acid sequence based amplification(NASBA)is an isothermal amplification program which is mediated by a pair of special primerin vitro.The technology could be operated easily and fast.It has been widely applied in the detection of many viruses,that infect human and animals,depended on its high specificity and sensibility.Its high specificity and sensibility has been represented in the detection of avian influenza virus,newcastle disease virus,porcine transmissible gastroenteritis virus,food and mouth diease virus.The paper briefly introduced the principle,characteristics of NASBA and its application in the detection of livestock viruses in order to provide a new approach to the technology of viral detection.

NASBA;principle;viral detection

2010-12-17

天津市应用基础与前沿研究计划重点项目(08JCZDJC16800)

张荣升(1986-),男,山东临沂人,硕士研究生,主要从事动物分子病原学研究。*通讯作者

Q789

B

1007-5038(2011)07-0101-04