邻位连接技术及其在病原检测中的应用*

唐 娜,王金良,曲光刚,沈志强,2*

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院兽医生物技术重点实验室,山东滨州 256600;2.山东绿都生物科技有限公司,山东滨州 256600)

邻位连接技术及其在病原检测中的应用*

唐 娜1,王金良1,曲光刚1,沈志强1,2*

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院兽医生物技术重点实验室,山东滨州 256600;2.山东绿都生物科技有限公司,山东滨州 256600)

邻位连接技术(proximity ligation assay,PLA)是近年新研发的一种蛋白质体外分析技术,该技术运用邻位连接与实时定量PCR扩增原理,通过一对可特异性识别靶蛋白的邻位探针进行双识别并连接产生可PCR扩增的检测信号,实现蛋白质的定量检测。该技术综合了抗原抗体结合的高特异性和实时定量PCR技术的高灵敏度等多方面优势,已经迅速应用到生物标记因子检测、蛋白质功能研究等领域,在疾病病原学诊断方面也取得了初步的进展。论文综述了邻位连接技术的原理,并介绍了其在疫病病原学诊断领域的研究进展。

邻位连接技术;蛋白质分析;疾病诊断;病原学检测

由病原微生物引起的传染性疾病严重地影响着人类的健康和畜牧业的发展。为能迅速有效地发现与控制传染病,学者们一直在努力探索灵敏、准确、高效的病原检测方法。目前常用的动物疾病标准诊断方法有病原鉴定、凝集试验、血凝抑制试验(hemagglutination-inhibition test,HI)、间接荧光抗体试验(indirect fluorescent antibody test,IFA)、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫过氧化物酶单层试验(Immunoperoxidase monolayer assay,IPMA),以及聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)等[1]。但随着人们对早期诊断的要求日益增高,现有诊断方法的局限性日渐凸显。病原鉴定等方法耗时长,不利于尽早诊断;HI、ELISA等方法较简单,但检测灵敏度较低,可能出现假阴性;PCR技术的应用使病原检测方法研究取得一个飞跃性进展,但病原核酸检测并不能完全替代病原蛋白质的检测:病原感染时产生的蛋白质抗原的种类和数量远远多于病原核酸,某些病原蛋白质只特异性地出现在疾病感染的特定阶段;病原蛋白的活性关系着病原活性,病原核酸的检测结果并不能完全代表其实际效价;某些病原存在变异以及检测样品的成分复杂等,这些实际问题使得PCR等核酸检测方法的应用具有一定局限性[2]。因此,发展新的蛋白质检测方法,提高检测灵敏度,简化检测步骤,缩短检测时间,在动物疾病诊断、感染机制研究以及疾病防控等领域将产生重要意义。

自2002年首次报道以来,PLA技术在国外发展迅速,已经大量用于细胞因子的检测[3]、生物标记蛋白功能状态的观察[4-5],以及疾病的病理生理过程研究等人类医学研究领域[6-7]。本文对PLA技术的原理及其在病原诊断领域的初步应用进行了综述,以期为该技术在疾病诊断领域的应用研究提供依据。

1 邻位连接技术

PLA技术最早由Fredriksson S等[8]2002年首次报道提出。该技术以一种称为挂锁探针(padlock probe)的DNA连接技术为基础[9],对探针进行了一定的改造,将一对探针的寡核苷酸单链分别与蛋白识别因子相连接,使其可以同步结合到一个待测蛋白分子上,这样的一对探针被称为“邻位探针”。当2条邻位探针双双与相应靶位点结合后,在连接酶作用下,蛋白上距离适宜的一对邻位探针其寡核苷酸尾部的游离5′端和3′端可以发生邻位连接反应,将探针与蛋白连接形成一个环状的蛋白质-蛋白识别分子-单链DNA复合物。通过实时定量PCR扩增复合物中的单链DNA部分,可以灵敏地反映目的蛋白的存在,并在一定范围内对目的蛋白进行定量分析。而且,只有在一对探针均与目的蛋白结合,且相互间距离足够贴近时,邻位连接反应才能够发生,这使得PLA技术与PCR或其他检测方法相比,具有更高的特异性和检测灵敏度。

邻位探针是PLA技术的关键。邻位探针是由一对寡核苷酸单链和一种或一对蛋白识别因子连接而成。这对寡核苷酸单链必须是线性结构,游离端具备可发生连接反应的基团,且寡核苷酸链的长度与所检测蛋白质的大小及识别位点间的距离有关,根据寡核苷酸单链连接后的序列设计上下游引物、连接序列和实时定量PCR探针,要求上下游引物分别识别两条寡核苷酸单链,而连接序列必须准确涵盖两条寡核苷酸单链游离末端的数个至十几个碱基[8]。

邻位探针的蛋白识别因子的性质与种类决定了PLA检测的特异性与灵敏度。蛋白识别因子既可以是核酸[8],也可以是抗体等蛋白质[10]。最早报道的邻位探针其蛋白结合部分是一类经由指数富集的配基系统进化技术[11](systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)从随机核酸库中选择产生单链DNA“配基”(aptamer)。这类DNA“配基”可以特异地识别蛋白质上的某一位点。运用最多的识别因子是单克隆抗体或者多克隆抗体,因为抗体与靶蛋白的亲和力强,特异性高,较易制备。但制备探针必须将抗体与寡核苷酸单链进行人工连接,常用的连接方法有化学交联法和生物素-链亲和素法等。应用链亲和素-生物素法时,只需改变抗体种类便可以用于检测多种蛋白质分子,其适用范围广泛[12]。Darmanis S等[13]提出了生物素-链亲和素-生物素法,可以有效地增加连接效率,提高寡核苷酸单链结合比例,从而提高了检测灵敏度。此外,也可以根据所分析蛋白的特性,将抗体探针与DNA探针综合使用[14]。

通常采用实时定量PCR方法进行邻位连接后的放大检测。实时定量PCR方法具有非常高的灵敏度,并有定量检测功能[15],目前已经大量应用到PLA技术检测细胞生物标记因子等研究中。近来人们又将滚环扩增(rollingcircle amplification,RCA)技术应用到了PLA的放大检测中,建立了一种可对相互作用的蛋白质进行细胞或组织内定位的PLA方法,即原位PLA[16-17](in situ proximity ligation assay)。邻位探针与待测的2个具有相互作用的蛋白质分子分别结合,这2个蛋白质分子因为相互作用而邻近时,可发生邻位连接反应形成环状DNA,以此环状DNA为模板进行滚环扩增则可得到含有大量重复DNA序列的DNA单链。在邻位探针的DNA序列中加入有荧光标记,则可以直接观测到蛋白质在细胞中的定位,从而开展蛋白质功能研究。

2 邻位连接技术在病原检测中的应用

PLA技术以邻位连接反应为基础,结合了抗原抗体反应的高特异性和实时定量PCR的高灵敏度,可以直接分析复杂生物样品中的微量蛋白质,其检测灵敏度与PCR方法近似甚至更高,可以检测zeptomole级(10-21)的细胞因子[12]。PLA检测所需样品量少(仅1 μ L即可获得较好结果),检测时间短(仅需几个小时,与PCR相近),可直接检测各种未经处理的复杂生物样品。因此,该技术自首次报道后发展迅速,现已经广泛应用到蛋白质定量分析,蛋白质-蛋白质相互作用研究,蛋白质-核酸相互作用研究等多方面研究中,并初步形成了商品化检测试剂盒[2]。

但是,尽管PLA技术已经逐渐获得人类医学研究学者的广泛关注,其在病原诊断领域的应用仍处于起步阶段,目前仅有数篇关于病毒和细菌检测的报道。2005年Pai S等[18]最早根据细菌芽孢表面蛋白性质,合成多价短肽-DNA-藻红蛋白复合物作为PLA探针“burr”,通过实时PCR检测细菌芽胞,可以精确检测到100个炭疽杆菌、10个枯草芽胞杆菌、1个蜡样芽胞杆菌的芽胞。Gustafsdottir S M等2006年[19]建立PLA方法检测胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis)和猪细小病毒(Porcine parvovirus),与相应的ELISA法和定量PCR法的比较证明,PLA法的检测灵敏度能比常规ELISA检测方法提高3～4个数量级,且样品需要量少,是ELISA法的千分之一。2007年Nordengrahn A等[20]应用抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体合成邻位探针,建立了口蹄疫病毒(FMDV)野毒感染的诊断方法。该PLA方法可以检测到5个TCID50的病毒,检测病毒的灵敏度与实时定量 RT-PCR相近,是抗原捕获ELISA方法的100余倍。Schlingemann J等[21]将一株特异性针对禽流感病毒核蛋白的单抗生物素化,与商品化的链亲和素-寡核苷酸链进行连接合成邻位探针,所建立的禽流感PLA可以特异性地直接检测灭活的禽流感病毒各种血清型,且对同源性较高的传染性支气管炎病毒、新城疫病毒无明显交叉反应;PLA法的检测灵敏度与LUXTM实时定量PCR方法相近,但比ELISA方法高出3个～4个数量级,有望替代ELISA方法用作禽流感早期诊断的高通量筛选或补充办法。

在PLA方法的研究方面,引入了固相PLA方法,可以进一步降低检测限[4,19]。将抗体固定于PCR微孔板壁,加入待测病原或抗原蛋白孵育,通过洗涤去除样品中的未结合分子;加入邻位探针及连接试剂连接后,再洗涤去除剩余的游离探针,最后通过实时定量PCR检测。低浓度特异性抗体的加入和去除了游离PLA探针,可以大大降低检测的非特异性,使得固相PLA方法可以极其灵敏地分析复杂组分样品中的痕量微生物病原,其特异性远远高于定量PCR,有时甚至高于液相PLA。

目前国际市场上已经出现用于生物标记蛋白质分析的PLA试剂盒,但商品化病原检测PLA试剂盒的实现还需要进行大量的研究。

3 展望

PLA技术在病原检测领域的应用虽然很少,但已经初步展现出该技术的巨大优势,PLA具有极高的特异性,具有与常用实时定量PCR相近、高出ELISA(使用同一抗体建立的)3个～4个数量级的灵敏度;避免了核酸提取操作,极大程度上极高了高通量检测的可能性;可以检测灭活样本,保证了样品转移或运输过程中的安全性;基于实时定量PCR的PLA技术,具有定量检测功能,可以替代动物试验,用于病原蛋白质的定量分析,等等。这些优势符合诊断技术发展的需要,PLA技术必将成为未来诊断技术研究的热点。

但是应该看到,现有的PLA技术仍然处于实验室研究阶段,离推广使用仍有相当大的距离。未来的研究应该集中于易化操作、降低成本、实现高通量检测、检测技术标准化等方向,将这一高灵敏技术应用于疾病早期诊断等领域,大大提高蛋白质检测水平,提高疾病诊断准确率,推动疾病感染与致病机制研究出现新进展。

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Proximity Ligation Assay and Its Application in Pathogen Detection

TANG Na1,W ANG Jin-liang1,QU Guang-gang1,SHEN Zhi-qiang1,2

(1.Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Binzhou Animal Husbandry and Veterinary Research Institute in Shandong,Binzhou,Shandong,256600,China;2.LvduBiological Technology Co.,Ltd,Binzhou,Shandong,256600,China)

Proximity ligation assay(PLA)is a recently developed strategy for protein analysis in which a pair of proximity probes are designed to bind target proteins via a DNA ligation reaction of oligonucleotides resulting in the formation of an amplifiable DNA strand suitable for real-time PCR.Because of the extremely sensitive and specific detection of proteins,PLA has been wildly used in biomarkers identification,protein functional study,and primary application on the diagnosis of diseases.Here we discussed the basic principle and the potential applications of PLA in pathogen detection.

proximity ligation assay;protein analysis;disease diagnosis;pathogen detection

Q789

A

1007-5038(2011)07-0077-03

2010-12-08

唐 娜(1982-),女,江苏连云港人,助理研究员,硕士,主要从事动物疫苗与诊断试剂研究。*通讯作者