牛瘤胃微生物定量测定方法研究进展

荆元强,宋恩亮,杨维仁,刘桂芬,谭秀文,万发春*

(1.山东农业大学动物科技学院,山东泰安 271018;2.山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东济南 250100;3.山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,山东济南 250100)

牛瘤胃微生物定量测定方法研究进展

荆元强1,2,3,宋恩亮2,3,杨维仁1,刘桂芬2,3,谭秀文2,3,万发春2,3*

(1.山东农业大学动物科技学院,山东泰安 271018;2.山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东济南 250100;3.山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,山东济南 250100)

瘤胃微生物数量测定一直是反刍动物营养的难点之一。传统的定量方法有亨氏滚管法和最大可能计数法(MPN)两种,方法简单,但工作量大,测定结果与实际存在偏差。现代分子定量技术的出现和发展,为瘤胃微生物数量的测定提供了一种新的思路和方法。如核算分子杂交技术、变性梯度凝胶电泳(DGGE)或温度梯度凝胶电泳(TGGE)、定量PCR技术等。随着现代分子定量技术的不断发展和完善,人们对瘤胃微生物的定量研究必将更加深入。论文简要对瘤胃微生物数量测定方法进行了综述,旨在为开展瘤胃微生物的研究提供参考。

瘤胃微生物;传统定量;分子定量

反刍动物的瘤胃是一个复杂而又独特的微生态系统,其内栖息着多种多样的微生物。这些微生物的存在使瘤胃成为反刍动物消化吸收的最重要部位。因此,研究瘤胃微生物的种类和数量变化有助于探索瘤胃在反刍动物消化代谢体系中的作用机理,进而达到调控瘤胃功能的目的[1]。长期以来研究人员都采用传统的定量方法来测定瘤胃微生物的种类和数量变化。然而,瘤胃微生物生长要求严格厌氧环境,这使得大部分细菌无法培养。因此,传统的培养、直接观察的定量方法不能准确测定瘤胃微生物的数量[2]。近年来,随着现代分子生物学技术突飞猛进的发展,逐步建立了较为完善的分子定量方法用于测定瘤胃微生物种类和数量变化。与传统定量方法相比,现代分子生物学技术能够准确、快速、高效的定量测定瘤胃微生物,是瘤胃微生态系统研究的必然趋势[3]。

1 瘤胃微生物组成

瘤胃内栖息着复杂、多样、非致病性的微生物,包括细菌、真菌、原虫和古菌等,还有少数噬菌体[4-5]。在瘤胃微生物中,细菌的数量巨大,种类最多,其种类和数量受饲料性质、采食后的时间、宿主生理状态等多种因素的影响。通常情况下瘤胃内容物中的细菌数量为1010～1011cfu/mL。目前,人们已经从瘤胃中分离出29个属的200多种细菌,其中绝大多数为厌氧菌和兼性厌氧菌,最主要的有纤维降解菌、淀粉降解菌、瘤胃产甲烷菌等[6]。瘤胃内的细菌对于降解饲料有效成分有非常重要的作用。细菌之间以及细菌与其他微生物之间的相互作用有助于挥发性脂肪酸和微生物蛋白的合成[7]。

瘤胃原虫是瘤胃微生态系统中重要的一部分,按其形态可以分为瘤胃鞭毛虫和瘤胃纤毛虫两大类,以纤毛虫为主。在瘤胃内原虫数量比细菌少的多,一般为105～106cfu/mL,但原虫个体较大,在生物量上并不比细菌少[8]。瘤胃纤毛虫不但可将植物纤维和淀粉转变成挥发性脂肪酸,还可吞食一定量的瘤胃细菌,从而降低瘤胃细菌消化淀粉的速率,维持瘤胃内环境的相对稳定。瘤胃纤毛虫的繁殖速度非常快。

瘤胃中的真菌数量不多,但种类较多,迄今为止,从瘤胃中分离到的厌氧真菌多达6个属16种。瘤胃真菌相对是严格厌氧的,正常瘤胃内容物中厌氧真菌的游动孢子数为103～105cfu/mL[9]。依据菌丝的形成方式瘤胃真菌可分为单中心和多中心两种类型,其中,单中心类型真菌的菌丝体形成单个孢子囊,而多中心类型真菌的菌丝体则可形成多个孢子囊,这些孢子囊均可释放出游动的孢子。孢子可附着在饲料上生长,逐渐形成新的菌丝体[10]。由于瘤胃真菌是瘤胃中分泌纤维素酶的主要微生物,因此成为当前研究的热点之一。

2 瘤胃微生物的传统定量方法

由于瘤胃内微生物的种类繁多,很多在体外根本无法培养。因此,从20世纪50年代开始研究人员就一直在寻求测定瘤胃微生物数量和种类变化的技术,并建立了一系列不同的方法,其中最为经典的是亨氏滚管法和最大可能计数法。

2.1 亨氏滚管法

亨氏滚管法因最早是由Hungate R E于1969提出而得名[11]。其基本步骤为:在亨氏管中的培养基上接种,流水冷却。将凝固后的培养基放入39℃培养箱培养数天后,挑取滚管壁上出现的单菌落放入新鲜的培养基培养。新培养的菌液经过多次滚管和单菌落分离后即可得到纯的菌株。通过滚管后菌落的多少可对瘤胃细菌和真菌培养菌计数,也可用于瘤胃液中细菌和真菌的活菌计数。但这种方法存在着很大的局限性。因为大多数瘤胃微生物都是厌氧的,而保持绝对厌氧环境存在很大的难度,而且很多瘤胃微生物在体外无法培养[12]。

2.2 最大可能计数法

除亨氏滚管法可用于计数活菌外,目前最常用的传统定量方法是MPN。其基本要点是先梯度稀释接种物,然后每个稀释度经过培养后通过直接观察微生物的生长情况,或对培养液进行pH检测确定每管是否有微生物生长,最后根据MPN表换算确定微生物的浓度。Dehority B A等[13]发表了用于瘤胃细菌的MPN计数法,并发现此法与滚管法的总细菌计数结果相一致。

3 瘤胃微生物的现代分子技术定量方法

由于瘤胃微生物培养的条件高、难度大,再加上传统的计数方法工作量大、耗时长,对一些不可培养的微生物又无法计数等,导致瘤胃微生物的定量研究一直进展缓慢。而现代分子生物技术的兴起和发展,使建立快速、科学、灵敏的瘤胃微生物定量方法成为可能[14]。

3.1 核酸分子杂交技术

该技术是20世纪70年代发展起来的,其原理是基于核酸分子具有互补配对的特性,用特异性探针和待测样品核酸杂交,然后检测。特异性探针常用16 S rDNA/rRNA分子的保守序列来设计。这种方法最大的优点是可以检测一些尚不能成功培养的瘤胃微生物[15]。

3.1.1 斑点杂交技术和狭线杂交技术 斑点杂交技

术(dot hybridization technique,DHT)和狭线杂交技术

(technique,SHT)是现代分子生物学的标准技术。其方法是通过用特异的探针与样品杂交,估计样品点发射出的信号强度,与已知浓度的标准品信号强度进行比较,确定待测样品中靶序列的量;也可利用通过探针和特异探针在相同条件下分别对同一样品进行杂交后的相应信号强度比来计算特异探针所对应的RNA占通用探针所对应的靶RNA的百分含量[16]。但是,即使是同一张杂交膜上同一样品的杂交信号有时也不稳定,结果重现性差,在定量研究中的应用效果不够理想。因此,这种技术在瘤胃微生物的定量方面未得到广泛应用[10]。

3.1.2 荧光原位杂交 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)是采用特异的荧光标记探针在未破碎的细胞内与它的互补序列完整结合,通过荧光信号检测核酸序列。FISH结合图形分析能快速计数微生物数量,同时还可以对不同类群的微生物在细胞水平上进行原位的定量分析。

Mackie R I等[17]采用FISH技术测定了不同反刍动物中颤螺菌的含量。Soliva C R等[18]用总甲烷菌和四个种类甲烷菌(甲烷杆菌、甲烷球菌、甲烷微菌和甲烷八叠球菌)的特异性探针研究了肉豆蔻酸对甲烷生成和甲烷菌数量的影响。这些研究充分说明FISH技术可用于定量瘤胃微生物。但是,该技术容易受到样品微生物生理状态的影响,所以在检测中会存在一定的偏差[19]。

3.2 变性梯度凝胶电泳或温度梯度凝胶电泳

DGGE或TGGE都属于DNA指纹技术。DGGE技术发展最为迅速,其原理是通过不同的变性剂梯度,显示不同DNA的差异片段。DGGE的方法是将PCR扩增得到的等长的DNA片段加入到含有变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,由于DNA片段空间构型的变化会改变电泳速度,因此,会在不同变性剂梯度凝胶位置上呈现各自的条带。停留在相同位置的条带,可视为具有相同的 DNA序列[20]。DGGE或TGGE技术已被广泛应用于微生物的定量和多样性的研究。但是,该技术对于瘤胃中含量很少的微生物,当其DNA在DNA总量中不足1%时就很难检测到[21]。因此,在微量瘤胃微量微生物的定量中不理想,有待于进一步提高和完善。

3.3 定量PCR技术

PCR技术是由美国科学家Muliis K于1985年发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的分子生物学技术[22]。定量PCR技术是对普通PCR技术的进一步发展和补充。其中,竞争PCR技术和荧光实时定量PCR因其定量准确、迅速等优势而开始被广泛应用于微生物定量研究中,在瘤胃微生物的定量研究中也显示出了很好的应用。

3.3.1 竞争PCR技术 当瘤胃液细菌数低于总菌数的0.01%时,核酸分子杂交法虽然不能准确测定,但其

rRNA定量方法却极大地推动了目标rDNA定量方法的发展,如竞争PCR技术。该技术能够排除管间及样本间的变化误差,可用于核酸的绝对定量和低拷贝基因的定量测定。这种技术在瘤胃微生物的定量研究中已被广泛应用[14]。竞争PCR技术虽然定量相对准确,

但耗时较长,对于大量样品进行定量研究时存在一定的难度。Sekhavati M H等(2009)首次建立了针对瘤胃厌氧真菌的竞争定量PCR方法,通过与基于几丁质测定的真菌定量方法相比较,验证了该方法在体外条件下的有效性[23]。

3.3.2 荧光实时定量PCR 实时定量PCR(real-time

quantitative PCR,RT-PCR)技术也是在普通PCR技术基础上发展起来的一种高灵敏的核酸定量技术。这种技术是在PCR的反应体系中加入荧光标记物质,当荧光标记物与新合成的双链DNA嵌合后,就可根据荧光信号的累积实时监测整个PCR进程,最后通过与标准曲线比较产物积累的速度(时间)来间接对未知模板进行定量分析。RT-PCR技术不仅实现了从定性到定量的飞跃,而且在保持传统PCR灵敏、快速等特点的基础上,具有特异性强、定量准确、重复性好、不存在 PCR过程后处理的污染问题等众多优点,已经被广泛应用到瘤胃微生物的定量分析上。Bu D P等[24]首次采用RT-PCR方法研究了日粮中添加胡麻油和豆油对奶牛瘤胃产琥珀丝杆菌、瘤胃黄华球菌和瘤胃白色球菌数量变化。

目前,RT-PCR技术已广泛应用在甲烷菌的检测中[25]。Hook S E等[26]利用RT-PCR技术分析了在采食相同日粮条件下泌乳奶牛瘤胃甲烷菌数量的变化,研究结果发现添加莫能菌素的六个月内甲烷菌数量无显著变化。Guo Y Q等[27]利用RT-PCR方法检测了甲烷生成被抑制时瘤胃甲烷菌数量的变化,发现甲烷排放和甲烷菌数量的变化并不一致。

4 展望

瘤胃是生物界中最复杂的生态系统之一,在反刍动物的消化过程中扮演着至关重要的角色。由于传统方法不能够准确测定瘤胃微生物数量,限制了对它的深入研究。近年来随着现代分子生物学技术的发展,使分类瘤胃微生物及准确定量数量成为可能,研究人员对瘤胃微生物的研究也进一步深入。今后,随着传统定量技术和现代分子定量技术的结合和进一步发展,必将会大大提高瘤胃微生物数量测定的准确度,拓展瘤胃微生物功能研究的深度和广度。

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Progress on Quantification Methods of Bovine Rumen Microbes

JING Yuan-qiang1,2,3,SONG En-liang2,3,YANG Wei-ren1,LIU Gui-fen2,3,TAN Xiu-wen2,3,W AN Fa-chun2,3

(1.College of Animal Science and Technology,Shandong Agricultural University,Taian,Shandong,271018,China;2.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine,Shandong Academy of Agricultural Sciences,J inan,Shandong,250100,China;3.Shandong Key Laboratory of Animal Disease Control and Breeding,J inan,Shandong,250100,China)

The quantification of rumen microorganisms has been one of the difficulties of ruminant nutrition.The traditional methods comprise the classical roll-tube technique and maximum possible count technique.The appearance and development of molecular quantitative methods have provided a new idea and methods for quantifying rumen microorganisms.Such as:accounting hybridization,DGGE or TGFE,real-time PCR.With the constantly developing and improving,molecular quantitative methods will be in-depth to further study.The author reviewed the quantification methods of rumen microbes briefly for providing a reference for the research of rumen microorganisms.

rumen microbe;traditional quantification;molecular quantification

S854.47

A

1007-5038(2011)07-0093-04

2010-12-27

国家现代农业产业技术体系(肉牛)、公益性行业农业科研专项经费课题(nyhyzx07-036-01-01,nyhyzx07-036-05,20090300608);省应用创新项目“优质高档肉牛生产技术研究”

荆元强(1984-),男,山东平度人,硕士研究生,主要从事动物营养与饲料科学研究。*通讯作者