林蛙油对大鼠肝纤维化的影响

李 艳 扈昕虹 郭素红 袁忠海 侯毅鞠 郝 峰 张 磊 许会静 李正袆

(吉林医药学院，吉林 吉林 132013)

林蛙油(又称为蛤蟆油，田鸡油，哈什蚂油)为雌性林蛙输卵管的干制品，含有多种蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、脂溶性维生素、微量元素、固醇类化合物、雌激素等含量甚高，具有提高机体的抗氧化能力，降血脂、抗衰老，防治肿瘤、增强机体免疫功能等作用〔1〕，但其活性成分对肝纤维化的影响及机制不十分清晰。本研究旨在探讨林蛙油对肝纤维化形成的影响及抗肝纤维化的机制。

1 材料与方法

1.1 动物 选择230～280 g、成年雄性Wistar大鼠100只，清洁级，由吉林大学白求恩医学部动物实验中心提供。基础饲料由吉林医药学院实验动物中心配制。

1.2 药品及试剂 林蛙油:购买长白山林蛙干油，由本校药学院雷均涛教授鉴定为真品。1 g林蛙油加蒸馏水30 ml，浸泡10 h。林蛙油泡好后，颜色雪白，膨大，略带腥味，松软而有弹性;用匀浆机制成匀浆液，冷冻保存，大鼠灌胃。给药量按动物体表面积计算，高剂量0.3 g/100 g体重大鼠，低剂量0.15 g/100 g体重大鼠。一氧化氮(NO)检测试剂盒、羟脯氨酸(Hyp)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒、丙二醛(MAD)测定试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所;丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)均购于中生北控生物科技股份有限公司，用全自动生化分析仪测定;秋水仙碱、四氯化碳(CCl4)、橄榄油为国产分析纯试剂。

1.3 分组 Wistar大鼠85只，随机分为7组，其中正常组10只，橄榄油对照组12只，肝硬化模型组15只，秋水仙碱组12只，林蛙油低剂量组13只，高剂量组12只及肝硬化自然恢复组11只。

1.4 模型的复制 正常组大鼠腹腔内注射生理盐水0.2 ml/100 g，2次/w;橄榄油对照组大鼠腹腔内注射橄榄油，2 ml/kg，2次/w;CCl4模型组大鼠腹腔内注射体积分数为0.40的CCl4(溶于橄榄油中，除菌过滤)，首次给药0.3 ml/100 g，以后0.2 ml/100 g，2次/w。从第9周起，从大鼠尾静脉采血进行肝功能项目检查，测定ALT、AST、ALP、GGT及总胆红素，结果模型组较对照组明显升高，血清白蛋白水平则明显下降(P＜0.05)，各组处死2只，病理组织学证实造模组大鼠有典型的纤维间隔增宽，形成肝纤维化。10 w末大鼠停止造模(其后每周注谢1次40%CCl4，防止自然恢复)，并开始给予药物干预，造模后从CCl4组大鼠再分为肝纤维化模型组、林蛙油低剂量组、高剂量组、秋水仙碱组、自然恢复组。自然恢复组不作任何处置，任其自然恢复。秋水仙碱组按0.1 mg·kg-1·d-1(配制成0.01%浓度后按1 ml·kg-1·d-1)腹腔注射，2次/w，连续8 w。各组大鼠每周称量体重1次，根据体重变化情况调整给药剂量以及观察每组动物体重变化有无差异、进食量、毛色等情况，初步估计肝功能有无衰竭的可能，以降低造模造成的死亡率。实验大鼠均在18 w末处死，于末次灌胃24 h后，20%乌拉坦腹腔麻醉，肝素抗凝，腹主动脉取血，离心，分离血清待测。大鼠肝脏冷盐水快速灌注，提取，称重，并做10%肝脏组织匀浆，待测Hyp。实验中有15只大鼠死亡未列入统计。

1.5 统计学方法 计量资料用统计软件SPSS11.5进行方差分析及非参数检验。实验数据用±s表示。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 在实验过程中，空白对照组大鼠营养状况良好，体重自然增加，行动敏捷，食欲正常，皮毛密集而有光泽。肝硬化模型组大鼠腹部膨隆，精神萎靡，倦卧少动，易激惹，皮毛干涩，个别大鼠趾甲易出血，大鼠头颈背部、眼眶周围及前肢出现轻度脱毛，脱毛处皮肤颜色、质地未见异常，蓬松少华，食欲欠佳，体重增长缓慢或不增长，死亡率高。林蛙油用药组大鼠精神、毛色及进食量均好于肝硬化模型组。实验过程中模型组大鼠死亡9只，秋水仙碱组和林蛙油高剂量组各死亡3只。死亡原因经解剖分析均为CCl4中毒及灌注损伤死亡。

2.2 大鼠肝功能实验室检查 ALT、AST、ALP、GGT的含量均有明显升高，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);林蛙油治疗的低、高剂量组血清ALT、AST、ALP、GGT含量均低于模型组，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.3 肉眼观察 正常对照组大鼠肝脏外观红润，表面光滑，质地较软;肝纤维化模型组大鼠肝脏呈黄褐色，表面粗糙，部分见较多细小结节，质地较脆。治疗各组大鼠肝脏呈褐色，表面粗糙，部分可见细小结节，质地偏硬。

2.4 林蛙油对肝纤维化大鼠抗氧化能力的影响 见表2。

2.5 大鼠体重、肝湿重及肝指数变化 肝指数=肝湿重/末次体重×100%。见表3。

表1 肝纤维化大鼠肝功能实验(±s)

表1 肝纤维化大鼠肝功能实验(±s)

与空白对照组比较:1)P＜0.01，与模型组比较:2)P＜0.01，与秋水仙碱组比较:3)P＜0.01，与林蛙油组:4)P＜0.01。下表同

分组 n ALT(U/L) AST(U/L) ALP(U/L) GGT(U/L) Hyp(μg/ml)空白对照组10 43±17 124±21 71±25 2.4±0.9 5.5±1.4橄榄油组 12 46±21 117±27 83±30 2.1±1.1 5.2±0.8林蛙油低剂量 13 181±802) 372±2142) 205±1122) 2.6±1.42) 7.7±1.52)林蛙油高剂量 12 156±652)3) 323±1812)3) 172±942)3) 2.2±0.92)3) 6.3±2.22)3)秋水仙碱组 10 214±912) 405±2262) 249±1312) 2.7±1.42) 8.5±2.92)自然恢复组 11 336±1084) 617±3054) 423±1814) 3.1±1.74) 10.7±3.44)模型组 12 348±1171) 683±2731) 511±1721) 3.9±2.01) 11.1±0.71)

表2 肝纤维化大鼠抗氧化能力的测定(±s)

表2 肝纤维化大鼠抗氧化能力的测定(±s)

分组 n NO(μmol/L) SOD(U/ml)GSH-Px(U)MDA(nmol/ml)空白对照组10 20.5±18.2 169±26 678±71 5.1±1.1橄榄油组 12 24.1±13.4 154±24 621±74 5.9±1.6林蛙油低剂量13 46.8±11.22)3)103±312)3) 482±602)3) 8.6±2.32)3)林蛙油高剂量12 33.1±12.32)3)136±372)3) 524±892)3) 6.4±1.72)3)秋水仙碱组 10 50.3±23.52) 121±412) 473±832) 8.2±2.42)自然恢复组 11 68.6±21.74) 71±234) 396±754) 10.5±3.24)模型组 12 70.2±27.11) 67±171) 359±821) 11.3±2.81)

表3 大鼠体重、肝湿重及肝指数变化(±s)

表3 大鼠体重、肝湿重及肝指数变化(±s)

分组 n 体重(g) 肝湿重(g) 肝指数(%)正常组10 387±29 10.93±1.4 2.82±0.7橄榄油组 12 382±32 11.45±2.9 3.00±0.3林蛙油低剂量组 13 275±332)3)10.66±1.72)3)3.88±0.92)3)林蛙油高剂量组 12 293±222)3)10.22±2.42)3)3.49±1.42)3)秋水仙碱组 10 262±272) 11.04±3.02) 4.22±2.42)自然恢复组 11 251±244) 11.25±2.74) 4.48±1.64)模型组 12 236±331) 12.47±3.31) 5.28±2.31)

3 讨论

肝纤维化是一个可逆的过程，将病变终止于肝纤维化阶段，对于慢性肝病的防治具有重要作用。近年来我国致力于中医中药抗肝纤维化的研究，消除病因、阻断和抑制肝纤维化的进程是目前防治肝硬化的主要手段〔2，3〕。

本实验采用CCl4皮下注射的方法制备肝纤维化模型，以观察林蛙油对肝纤维化的疗效并探讨其发生机制。本文结果提示林蛙油可以显著降低CCl4诱导的肝纤维化大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT的水平，较秋水仙碱药物对照组效果明显，说明林蛙油具有保护肝脏、改善肝功能作用;Hyp是胶原蛋白特有的氨基酸，是胶原代谢的重要产物，在肝纤维化时胶原蛋白合成增多，其在肝脏中的含量可反映胶原代谢的变化情况，与肝纤维化程度相平行，是评估胶原蛋白含量和肝纤维化程度的直接指标，本实验结果说明肝纤维化时胶原合成十分活跃，林蛙油组能使升高的Hyp降低，减少胶原蛋白的产生，并好于秋水仙碱组，表明林蛙油对大鼠肝纤维化程度具有较好的逆转作用。

体内抗氧化酶系统如SOD、GSH-Px是体内清除自由基的关键酶，可清除自由基，抑制自由基启动的脂质过氧化反应，防御自由基对机体组织的损伤。MDA为脂质过氧化物的终产物，它使蛋白质核酸脂类发生交联，使生物膜变性，细胞突变衰老和死亡。NO是一种很活跃的自由基，近年来研究发现ON及一氧化氮合成酶(NOS)在肝纤维化的发生、发展及转归中起着重要作用〔4〕，本研究说明肝损伤时产生大量自由基和脂质过氧化物，导致二种酶被耗竭，从而使机体抗氧化防御机制受损，不能清除过多的自由基而导致肝脏受损。同时因肝细胞受损清除能力下降，产生脂质过氧化物促进肝星状细胞活化，同时激活各种细胞因子，刺激细胞外基质(ECM)的合成，抑制ECM降解，导致肝纤维化〔5～7〕，所以模型组肝脏中Hyp增高。另外，林蛙油高剂量组大鼠血清SOD、GSH-Px活性较模型对照组显著升高，MDA含量则明显降低，表明林蛙油有降低自由基生成、减轻脂质过氧化的作用，能够拮抗CCl4的毒性作用，保护肝细胞，减轻肝损伤，加速清除自由基，防止其对肝细胞膜中不饱和脂肪酸的破坏，延缓细胞膜的老化和损伤，改善肝功能，这可能是抗脂质过氧化的结果。本研究发现肝硬化模型组大鼠血清NO明显升高，NO水平升高与实验性大鼠肝脏的损害的程度成正比，过量的NO有促进肝损伤的作用，也具有抑制肝细胞蛋白合成的作用。肝硬化时，肠道内毒素的生成和摄取增多，肝脏对内毒素清除功能减退，使内毒素进入体循环并发生内毒素血症，内毒素血症又可直接和(或)间接通过激活巨噬细胞、枯否细胞释放、肿瘤坏死因子(TNF)等来诱导产生大量NO，造成NO水平升高，NO的合成和分泌增加，导致血管扩张，部分组织血流量增加，肝内血流分布不均，最终导致门脉血流动力学紊乱，使肝病的病情加重。因此，检侧血清NO含量对临床估计肝硬化的病情进展及疗效观察有一定的价值。但林蛙油高剂量组大鼠血清NO水平下降，提示选择林蛙油等合适的抑制诱导型NO合酶(iNOS)药物适当地抑制NO过量产生，可能有助于减轻肝损伤。

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2 梁 健，安永辉，邓 鑫.中医药抗纤维化的研究进展〔J〕.辽宁中医杂志，2009;36(11):2007-9.

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5 张瑞娟，高润平，杨秀云，等.肝纤维化基因治疗的现状及展望〔J〕.中国老年医学杂志，2008;28(21)，2175-8.

6 张定凤.抗肝纤维化治疗的趋势〔J〕.中华肝脏杂志，2007;15(10):721-4.

7 刘海林，王 磊.肝纤维化的研究进展〔J〕.国际消化病杂志，2007;27(4):235-6.