β2-肾上腺素能受体基因多态性与老年慢性阻塞性肺疾病合并高血压的相关性

王 成 杨皑岚 李 华 毕鸿雁 傅玮萍 戴路明 陈 芬 谭 芳 符 琴 田陆云

(昆明医学院第一附属医院老年病科，云南 昆明 650032)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)与高血压(EH)都是一种发病机制复杂的疾病，环境和基因因素决定其发病和最终的表型。目前对COPD和EH基因易感性做了大量研究，在众多候选基因中，β2-肾上腺素能受体(β2-AR)基因引起了广泛重视。这个基因变化与支气管及血管反应都有关，有可能与COPD合并EH有着重要遗传相关性。本研究旨在阐明β2-AR基因多态性对COPD合并EH的发病是否有影响。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象 各组受检者均为无血缘关系的汉族人。①对照组60例，男50例，女10例，年龄(76.25±5.68)岁，均来自我院2009年3～7月健康体检者，经肺功能等检查排除了COPD、EH、哮喘、糖尿病及肝肾功能不良者。②COPD合并EH组60例，男47例，女13例，年龄(76.32±6.87)岁，均来自我院2008年9月至2009年7月住院病人，经病史、体检、X线胸片或肺部CT及肺功能等相关检查确诊的COPD合并EH患者并排除了哮喘、继发性高血压、糖尿病及肝肾功能不良者。诊断符合我国《慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2007年修订版)》及《2005年高血压治疗指南》。③COPD组60例，男49例，女11例，年龄(76.73±7.25)岁，来自我院同期的住院病人，经病史、体检、X线胸片或肺部CT及肺功能等相关检查确诊的无高血压的COPD患者并排除了哮喘、糖尿病及肝肾功能不良者。诊断符合我国《慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2007年修订版)》。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA提取 抽取外周血2～3 ml，以2%的EDTA抗凝，采用Promega DNA提取试剂盒提取外周血DNA。

1.2.2 PCR扩增

1.2.2.1 PCR扩增的引物设计 引物参照有关文献设计〔1〕，采用等位基因特异性聚合酶链反应(AS-PCR)方法，分别检测β2-AR单核苷酸多态性Arg16Gly和Gln27Glu。扩增引物序列如下:Arg16Gly多态性，Arg16:5'-CTTCTTGCTGGCACCCAATA-3'，Gly16:5'-CTTCTTGCTGGCACCCAATG-3'，反 义 链 5'-CCAATTTAGGAGGATGTAAACTTC-3';Gln27Glu多态性，GLn27:5'-GGACCACGACGTCACGCAGC-3'，Glu27:5'-GGACCACGACGTCACG CAGG-3';反义链:5'-ACAATCCACACCATCAGAAT-3'。以上引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2.2.2 PCR扩增的反应体系及反应条件 反应总体系为50 μl，其中 DNA 模板 1 μl，dNTP(25 mmol/L)1 μl，Mg 离子(2.5 mmol/L)5μl，TapDNA聚合酶1 U，上下游引物各1μl和10×PCR Buffer 5μl。反应条件为;94℃预变性5 min;94℃变性2 min，16位点55℃退火1 min，27位点52℃退火1 min和72℃延伸1 min共35个循环;终末72℃延伸10 min。

1.2.3 Beta2-AR基因多态性的检测 将AS-PCR的扩增产物加入含EB的1%的琼脂糖凝胶样品孔内，置于电泳槽中100 V电泳50 min，在紫外透射仪下观察结果并摄像。根据各电泳道所显示的电泳条带判断其基因型，如仅出现一条氨基酸电泳条带则为纯合子，出现两条氨基酸电泳条带则杂合子。

1.3 统计学分析 采用SPSS12.0统计软件包，计量资料用±s或用四分位间距表示，组间频率比较用R×C表χ2检验，多个组间计量资料的比较用单向方差分析及进一步的多重比较(LSD法)。

2 结果

2.1 β2-AR基因16、27位点基因多态性的检测 见图1和图2。β2-AR基因16位点基因PCR扩增产物为913 bp，β2-AR基因27位点PCR扩增产物为420 bp。

2.2 各组一般临床特点比较 见表1。COPD合并EH组及COPD组肺功能与对照组间差异显著(P＜0.05)。

表1 各组间的一般临床特点比较(±s)

表1 各组间的一般临床特点比较(±s)

与对照组比较:1)P＜0.05

组别 吸烟支数(支/年) FEV1% FEV1/FVC%COPD合并EH组 300 71.58±11.361) 57.16±8.901)COPD组 293 71.12±12.151) 56.88±9.131)对照组225 96.08±16.75 78.08±5.42

图1 β2-AR基因16位点基因多态性的检测

图2 β2-AR基因27位点基因多态性的检测

2.3 β2-AR 16、27位点等位基因频率在不同人群的分布Gly16等位基因在云南汉族人群、中国北方汉族人群〔2〕、中国台湾人群〔1〕中的频率分别为36%、48%、40%，其在这三个群体中的分布差异无统计学意义(χ2=3.079，P＞0.05)。Gly16等位基因在云南汉族人群、欧洲人群、非洲人群中的频率分别为36%、72%、50%，其在这三个群体中的分布差异有统计学意义(χ2=26.422，P＜0.05)。Glu27等位基因在云南汉族人群、中国北方汉族人群、中国台湾人群、欧洲人群、非洲人群中的频率分别为12%、36%、29%、50%和27%。其在各群体中的分布差异有统计学意义(χ2=15.969，35.114，P ＜0.05)。

2.4 各组β2-AR 16、27基因多态性分布 在云南汉族人群中，16位点ArgArg、ArgGly及GlgGly基因型频率在对照组分别为40%、48%、12%;在 COPD合并EH组为47%、33%、20%;在COPD组为43%、42%、15%。其在三组中的分布差异无统计学意义(χ2=5.435，P＞0.05)。16位点突变等位基因频率在对照组为36%，在 COPD合并 EH组为37%，在 COPD组为36%，其在三组中的分布差异无统计学意义(χ2=0.029，P＞0.05)。27位点GlnGln、GlnGlu及GluGlu基因型频率在对照组分别为48%、10%、2%;在COPD合并EH组为53%、5%、2%;在COPD组为50%、8%、2%。其在三组中的分布差异无统计学意义(χ2=3.590，P＞0.05)。27位点突变等位基因频率在对照组为12%，在COPD合并EH组为7%，在COPD组为10%，其在三组中的分布差异无统计学意义(χ2=1.451，P＞0.05)。

2.5 β2-AR基因16、27位点基因型与肺功能的关系 16位点ArgArg、ArgGly及GlyGLy基因型中FEV1值的差异有统计学意义〔(81.50±2.60)%，(68.28±4.43)%及(52.02±9.36)%，F=133.292，P＜0.05〕。进一步经LSD法比较:ArgArg与Arg-Gly组、ArgArg与GlyGly组、ArgGly与GlyGly组间的FEV1的差异均有统计学意义(P＜0.05)。27位点 GlnGln、GlnGlu及GluGlu基因型的 FEV1值的差异无统计学意义〔(71.70±11.64)%、(70.53±11.74)%及(72.85±2.33)%，F=0.048，P ＞0.05〕。

3 讨论

本研究结果提示不同种族间Beta2-AR基因的SNP分布频率存在差异，这种差异可能是导致不同种族Beta2-AR分布密度和受体反应性差异的原因之一。

目前对COPD和EH的流行病学、发病机制及自然病程仍不是十分清楚，但已经明确的是，两者均是由环境与遗传因素共同作用的多基因遗传疾病。在众多的候选基因中，因为β2-AR基因的变化与支气管及血管反应性都有关，该基因逐渐引起了广泛重视。Gly16变异型可增强长期使用β2-AR激动剂诱导的受体下调作用，而Glu27对β2-AR激动剂诱导的受体反应性下调有抵抗作用。Glu27纯合子患者比Gln27纯合子患者气道反应性低，可能是由于Gln27β2-AR与循环中儿茶酚胺和外源性激动剂结合能下调β2-AR数目，而Glu27无此作用，因此Gln27个体具有更高的气道反应性，而气道高反应性是COPD患者呼吸道症状发生的危险因素。Ho等〔1〕研究提示Gly16等位基因增加COPD的易感性，而Gln27多态性在COPD组与对照组中的分布无统计学差异，但其与COPD的严重程度有关。曹霞等〔3〕研究表明β2-AR基因Gln27Glu基因多态性及单倍体可能参与COPD的发病机制。Melanie等〔4〕研究显示Arg16纯合子型与呼吸道的气喘症状有关，并会增加患COPD的风险，而Gln27纯合子型与呼吸道的气道高反应性(BHR)有关，会增加患哮喘的风险。提示 Arg16Gln27单倍体型与COPD、BHR和哮喘有密切关系。Bregger等〔5〕研究 Arg16Arg和Gln7Glu的基因多态性与COPD的发病无关。而Ranade等〔6〕研究显示Gly16等位基因与我国人群EH的关系密切，Gln27Glu基因多态性与EH的关系不明显。朱建等〔7〕研究表明对我国汉族人群而言，Beta2-AR16位点多态性基因型频率和正常血压人群无统计学差异，而Gln27纯合子型在高血压组明显高于正常血压人群，并提示Gln27纯合子型患EH的危险性比对照人群高2倍以上。

本研究提示Gly16等位基因的存在增加肺功能的损害，而27位点基因多态性与肺功能无关。该结果与Ho等〔1〕的部分研究结果相同。虽然我们未发现β2-AR基因27位点基因多态性对FEV1的显著性影响，但可能与检测到的该位点变异例数较少，未达到统计方法的判别范围有关。

本研究的结论是β2-AR基因16、27位点基因型多态性的分布在不同族群中存在差异，提示族群对基因突变可能有一定影响。在本研究人群中，β2-AR基因16、27位点基因多态性与COPD合并EH的易感性可能无相关性，但16位点的基因多态性与肺功能可能有关，在某种程度上影响疾病的严重程度。上述研究结果与以往研究存在不一致的原因可能是:一是COPD和EH的易感性不但受遗传因素的影响，还受到其他因素如吸烟、环境污染、气候等的影响，在我们的研究人群中，β2-AR基因多态性的影响可能被其他影响因素降低。二是COPD和EH作为多基因疾病，其具有遗传异质性，COPD和EH患者遗传背景的不同，可能引起研究结果的不同。三是从样本数量上看，这些研究都只是一些初步工作，需进一步扩大样本进行更深入研究。

1 Ho LⅠ，Harn HJ，Chen CJ，et al.Polymorphism of the beta2-adrenoceptor in COPD in Chinese subjects〔J〕.Chest，2001;120(5):1493-9.

2 高光凯，蒋一平，王士雯.中国北方汉族人群beta2-肾上腺素能受体基因多态性研究〔J〕.中国优生与遗传杂志，2002;10(1):18-20.

3 曹 霞，李清泉，陈国忠，等.慢性阻塞性肺病患者ⅠL-4、ⅠL-13以及ADRB2基因多态性的检测〔J〕.武汉大学学报(医学版)，2009;30(2):219-23.

4 Melaine C，Matheson A，Johns E，et al.beta2-adrenergic receptor polymorphisms are associated with asthma and COPD in adults〔J〕.Hum Genet，2006;51(11):943-51.

5 Bregger J，Steen VM，Eiken HG，et al.Genetic association between COPD and polymorphisms in TNF、ADRB2 and EPHX1〔J〕.Eur Re-Spir，2006;27(5):682-8.

6 Ranade K，Shue WH，Hung YJ，et al.The glycine allele of a glycine/Arginine polymorphism in the beta2-adrenergic receptor gene is associat-Ed with essential hypertension in a population of Chinese origin〔J〕.Am J Hypertens，2001;14(10):1196-200.

7 朱 建，江时森，曹 文，等.中国汉族人中beta2-肾上腺素能受体基因多态性与高血压病的关联性研究〔J〕.医学研究生学报，2003;16(2):123-6.