羟丁基壳聚糖的制备及其与鼠胚胎成纤维细胞的生物相容性研究

孙伟 季翔 汪谟贞 方月娥 赵宇 汪春兰

羟丁基壳聚糖的制备及其与鼠胚胎成纤维细胞的生物相容性研究

孙伟 季翔 汪谟贞 方月娥 赵宇 汪春兰

目的制备温敏型壳聚糖衍生物羟丁基壳聚糖（Hydroxybutyl chitosan，HBC），研究鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblasts，MEF）与HBC的相容性，探讨羟丁基壳聚糖作为组织工程材料的可行性。方法对壳聚糖化学改性制备HBC，研究其最佳制备条件。使用不同溶剂对HBC进行溶解实验；利用红外光谱、扫描电镜对产物结构进行观察。从小鼠胚胎中分离培养MEF；MTT法测定HBC对MEF活性的影响。结果制备的4种HBC均能溶于水，55℃反应14h的HBC 4水溶性较好。HBC溶液在37℃具有明显的溶胶-凝胶的转变，通过物理交联形成凝胶并可逆。不同反应条件下制得的4种HBC浸提液对MEF细胞的毒性均在0级或1级，表现出良好的生物相容性。结论成功制备羟HBC，HBC具有良好的温度敏感性及体温（37℃）下凝胶的特性，与MEF生物相容性良好，是一种具有应用前景的新型组织工程材料。

羟丁基壳聚糖鼠胚胎成纤维细胞温敏凝胶组织工程

壳聚糖作为一种天然的阳离子聚合物，对生物体细胞无抗原性，无致突变作用，不会产生排斥反应，是一种安全可靠的医用高分子材料，近年来作为组织工程支架及载体材料研究广泛[1-2]。但由于其具有复杂的双螺旋结构，大分子链上分布着许多氨基和羟基，能够形成分子内和分子间氢键，故壳聚糖的结晶性较高、溶解性较差，极大地限制了它的应用。通过化学改性可在壳聚糖分子中的重复单元上引入不同基团，生成相应的衍生物。这样既可改善壳聚糖的溶解性能，又可赋予壳聚糖更多的功能。

我们通过对壳聚糖进行羟丁基化改性，制备具有温敏特性的羟丁基壳聚糖（Hydroxybutyl chitosan，HBC），选用鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblasts，MEF），研究两者的生物相容性，探讨HBC作为组织工程材料的可能性。

1 材料和方法

1.1 实验动物

孕期14～16 d的孕小鼠4只（健康清洁级，体重不限），安徽医科大学实验动物中心提供。

1.2 材料与主要试剂

壳聚糖，普通型医药级，脱乙酰度90%（核磁方法测定），MW=4.0×105(黏度法)（浙江金壳生物化学有限公司）；环氧丁烷（1,2-Butylene Oxide）C4H8O，分子量72.11（东京化成工业株式会社）；DMEM培养液、胎牛血清（Hyclone公司）；噻唑蓝（MTT）（Sigma公司）；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器

超低温冰箱（SANYO公司，日本）；CO2培养箱（Heraeus公司，德国）；超净工作台（苏州净化设备厂）；84-1A型磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；透析袋（MW=8 000）（上海易佰聚经贸有限公司）；FA1104型电子天平（上海精密仪器仪表有限公司）；VECTOR-22型FT-IR红外光谱仪（Burker公司，德国）；X-650型扫描电子显微镜（日立公司，日本）；倒置显微镜（Olympus公司，日本）；BIO-TEK ELX800全自动酶标仪（宝特仪器有限公司，美国）；培养瓶、离心管、细胞培养板（Falcon公司，美国）。

1.4 实验方法

1.4.1 HBC合成

合成方法参考文献[3-4]，经改进后合成羟乙基和羟丙基壳聚糖。壳聚糖的合成过程大致分为：碱化、改性、后处理。不同反应条件下制成的HBC样品见表1。

1.4.1.1 碱化

10 g NaOH固体置于烧杯中，加入10 mL蒸馏水使其溶解；加入2 g壳聚糖粉末，常温搅拌8 h，充分溶胀后，放入-18℃冰箱中冰冻过夜；加入异丙醇20 mL，40℃搅拌1 h分散均匀，形成碱化壳聚糖2 g。

1.4.1.2 改性

2 g碱化壳聚糖，滴加环氧丁烷20 mL，一定温度加热，回流反应一定时间（共制成4组样品，表1），产物用无水乙醇沉淀，1/1（v/v)盐酸中和pH至中性，得到羟丁基壳聚糖粗产物。

1.4.1.3 粗产物处理

粗产物无水乙醇洗涤，过滤，加入丙酮静置沉淀，再经丙酮/乙醚反复离心洗涤3次，干燥研磨后放入Mw=8 000的透析袋中，放入加有约500 mL去离子水的广口塑料量杯中，置磁力搅拌器上动态透析72 h，12 h更换透析用水1次，透析结束后产物经50℃真空干燥，得精制白色粉末状HBC产品。

1.4.2 羟丁基壳聚糖的溶解性实验

相同条件，准备100 mL 1%醋酸水溶液、100 mL蒸馏水及100 mL 0.1 mol/L NaOH溶液3种溶液，判断标准以100 mL溶液中溶解壳聚糖或HBC的质量为依据，＞0.7为好，0.5～0.7为较好，0.3～0.5为一般，＜0.3为差。

1.4.3 HBC温敏凝胶化特性研究

将l g HBC溶解在50 mL 0.1 mol/L盐酸溶液中，配制2%HBC溶液，振荡混匀后，以少量0.02 mol/L的NaOH溶液调节溶液的pH值。参照文献[5]用试管倒置法研究HBC的温敏特性，将装有HBC溶液的试管直立置于不同温度的恒温水浴箱中，测试温度范围为18～50℃，记录不同温度下溶液的成凝胶行为。每隔约30 sec将试管45°倾斜，并观察液面是否随试管倾斜，当观察到液面不随着试管倾斜45°而倾斜，则再恒温约30 sec后，将试管倒置，溶液不再流动，则定义此时的温度为初始化凝胶温度，达到初始凝胶化温度后，恒温一定时间，得到水凝胶。

1.4.4 产物的结构表征

红外光谱分析：采用KBr压片法，将精制过的样品与KBr混合压片进行测试。

扫描电镜观察：将制得的水凝胶放在冷冻干燥箱中冷冻干燥，选取样品截面黏台，镀金后观察。

1.4.5 MEF培养及HBC对MEF存活的影响

1.4.5.1 MEF的原代和传代培养

从孕14～16 d的小鼠子宫取出胎鼠，反复消毒后用PBS和DMEM漂洗数次，剪下皮肤，将洗净的组织块剪成约1 mm3的小块，置入含DMEM和10% FBS的MEF培养基中原代培养，得到MEF[6-7]。原代培养的细胞达到80%～90%成片融合后，传代培养。将原培养液倒尽，PBS液漂洗2次，加入0.5 mL 0.25%胰酶消化，待细胞融合后，加2.5 mL含10% FBS的DMEM液终止消化，吹吸成细胞悬液，按1∶5的比例分装入新培养瓶，放入37℃、5%CO2、饱和湿度条件下传代培养，实验所用细胞均为第3～6代处于对数生长期的成纤维细胞。

1.4.5.2 MTT法检测HBC对MEF生长的影响

取3块96孔板，每板分7组。CS原料浸提液组：取原料壳聚糖0.02 g，先用2 mL PBS液浸泡过夜（24 h），37℃下加入1 mL细胞培养液过夜（24 h），高压灭菌；4组HBC浸提液液组：将制成的4种HBC分别称取0.02 g，用2 mL PBS液浸泡过夜（24 h），37℃下加入1 mL细胞培养液过夜（24 h），高压灭菌备用；阴性对照组：单纯细胞培养液（含10% FBS的DMEM培养液）；阳性对照组：5%苯酚水溶液。

将第3～6代的MEF制成细胞悬液，调整细胞浓度为3×104cells/mL后，接种到96孔板中培养，倒置显微镜下观察细胞进入对数生长期后，将原培养液吸出，各孔加入相应的待测样品液200 μL，每孔设3个复孔。温箱中培养48 h后取出96孔板，加入15 mg/mL MTT溶液20 μL，继续培养4 h；吸去上清液待结晶物完全溶解后，酶标仪测定490 nm吸光度[8]，并计算细胞相对增殖率（RGR）。细胞毒性评估将根据各组的细胞吸光度和RGR进行评价，转化为0～5级材料毒性评价[9]。

1.5 统计方法

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBC溶解性实验

4种不同反应条件下制得的HBC样品和原料壳聚糖，相同条件下分别置于100 mL 1%醋酸水溶液、蒸馏水、0.1 mol/L NaOH溶液中（表2）。各组样品均能溶于稀酸而不溶于碱性溶液，壳聚糖原料不溶于水，而改性后的HBC能溶于水，4种制备条件不同的壳聚糖溶解性也不同。70℃反应产物由于温度高，壳聚糖之间会产生交联从而导致水溶性下降。从水溶液样品上可见，HBC 1水溶性一般，溶液粘度较大；HBC 2反应时间适中，水溶性较好；HBC 3反应时间过长，导致产物交联现象产生，溶解度下降；降低反应温度并适当延长反应时间（55℃反应14 h）的HBC 4水溶性最好，已经得到了无色澄清透明的羟丁基壳聚糖水溶液。

表2 HBC的溶解性实验Table 2The solubility test of HBC

2.2 HBC温敏凝胶特性

通过试管倒置法，逐渐提高水浴温度，测得4组HBC样品均具有温敏特性，能够在体温（37℃）下转变为凝胶，各组初始凝胶化温度分别为34℃、20℃、22℃和29℃。HBC凝胶化临界温度20℃左右，在37℃时，HBC材料可以顺利转变为凝胶状态。

2.3 红外光谱和扫描电镜分析

经干燥研磨后的羟丁基壳聚糖为纤维状的白色粉末，均能溶于水。选取水溶性最好的HBC 4为代表，进行红外光谱和扫描电镜分析。壳聚糖经过羟丁基化改性后，得到侧链带疏水基团的壳聚糖链。图1为HBC 4样品的红外光谱图，图中箭头所示为特征官能团的吸收峰；1 462 cm-1处-CH3吸收峰的出现为判断羟丁基已经取代原有基团的最明显特征，此外还有C-O吸收峰变强并移动至1 060 cm-1附近。

图1 HBC4的红外光谱图Fig.1The IR image of HBC 4

HBC溶液在37℃时转变为凝胶状态。当温度低于凝胶化温度时，HBC溶液为可注射的流动黏性液体，当温度高于初始化凝胶温度或达到37℃，加热后即转变为不流动的固态凝胶。凝胶的形成是由氢键、离子间的相互吸引力和疏水力等物理作用形成。将制备的凝胶进行冷冻干燥，将其截面通过扫描电镜观测HBC水凝胶的微观形貌，发现HBC水凝胶具有多孔性的三维网络结构，空间网络较大，网间空隙较小（图2）。此种结构有利于吸收水份和药物，可以作为药物模型的载体和组织工程支架材料。

图2 HBC凝胶的扫描电镜图Fig.2HBC semisolid observed by SEM

2.4 HBC对MEF的细胞毒性

MTT法检测各组吸光度及RGR、毒性级别，根据细胞毒性与RGR的关系[9]，可见原材料壳聚糖及制备的4种HBC材料细胞毒性为0级或1级。HBC的4个样品对MEF细胞作用的RGR值与阴性对照相比无显著性差异，与相应的壳聚糖样品的比较也没有显著差异（P＞0.05），而与阳性对照间差异显著（P＜0.05）。因此，可认为壳聚糖及其衍生物HBC具有良好的生物相容性。

3 讨论

运用组织工程的方法修复外伤等导致的组织缺损，要求支架材料具有良好的生物相容性、理化性质和适宜的降解速率。壳聚糖作为一种自然界中存量极其丰富的碱性多糖，本身具有多种生物活性，其分子链上分布着许多氨基和羟基，化学性质非常活泼，通过改性后的壳聚糖衍生物改善了其水溶性，能够更好地为细胞提供繁殖所需的三维生长支架，在组织工程、药物及基因传输的研究中，壳聚糖作为新型的支架材料和缓释载体应用前景广阔[1，10]。

本实验通过对壳聚糖进行羟丁基化改性，成功制备了水溶性良好的HBC，能在37℃时转变为凝胶，具有良好的温敏特性。制备的HBC的凝胶化温度范围在20～34℃之间。凝胶的扫描电镜显示HBC凝胶是一种多孔性的网状结构，空间网络较大，网间空隙合适，可供药物及大分子蛋白质填充于凝胶网络结构中。

作为一种新的组织工程支架材料，在进行体内功能实验之前，须首先检测其生物相容性，确定对生物体细胞无毒无害才能使用。我们从胎鼠中培养获取大量的MEF[6-7]，原代培养MEF后，传代培养，取处于对数生长期的第3～6代的细胞用于实验，运用MTT法进行评价。本实验制备的HBC材料的毒级为0～1级，具有良好的生物相容性，符合组织工程材料的应用标准。

我们制备HBC温敏水凝胶材料的方法简单、安全、符合环保要求；与MEF复合培养结果表明，HBC对细胞生长无明显不良影响。HBC是一种可注射的、具有良好生物相容性和生物可降解性的材料，可作为药物递送载体及修复组织缺损的支架材料。可注射型温敏水凝胶具有自体适应性，可体温凝化，这是一般水凝胶所不具备的。

[1]Shi C,Zhu Y,Ran X,et al.Therapeutic potential of chitosan and its derivatives in regenerative medicine[J].J Surg Res,2006,133 (2):185-192.

[2]Prabaharan M,Mano JF.Chitosan-based particles as controlled drug delivery systems[J].Drug Deliv,2005,12(1):41-57.

[3]董炎明,吴玉松,王勉.甲壳素类液晶高分子的研究V.取代基个数及长度对羟乙基壳聚糖液晶性的综合影响[J].高分子学报, 2001,2:172-176.

[4]陈忻,袁毅桦,张莉萍,等.羟丙基壳聚糖的制备[J].合成化学,2004, 12(1):85-88.

[5]Chung YI,Ahn KM,Jeon SH,et al.Enhanced bone regeneration with BMP-2 loaded functional nanoparticle-hydrogel complex[J]. J of Control Release,2007,121(1-2):91-99.

[6]Helgason CD,Miller CL.Basic cell culture protocols,3th[M]. New Jersey:Humana Press Inc,2005,7-11.

[7]王国云,李栋,张辉,等.小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备条件的研究[J].山东大学学报(医学版),2005,43(5):396-400.

[8]Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:appfication to proliferation and cytotoxicity assays[J].J Immunol Methods,1983,65(1-2):55-63.

[9]Sahlin H,Nygren H.Cytotoxicity testing of wound-dressing materials [J].Altern Lab Anim,2001,29(3):269-275.

[10]Cai H,Zhang P,Ping CS,et a1.Synthesis and characterization of thermo and pH-sensitive hydrogels based on Chitosan-grafted N-isopropylacrylamide via γ-radiation[J].Radiat Phys Chem, 2005,74(1):26-30.

Preparation of Hydroxybutyl Chitosan and Its Biocompatibility Evaluation with Mouse Embryonic Fibroblasts

SUN Wei1,JI Xiang2,WANG Mozhen2,FANG Yue′e2,ZHAO Yu1,WANG Chunlan1.1 Deperment of Plastic Surgery,First Affiliated Hospital of Anhui Medical University,Hefei 230022,China;2 University of Science and Technology of China, Hefei 230026,China.Corresponding author:WANG Chunlan(Email:wangchunlan9@163.com);ZHAO Yu(E-mail: zhaoyuzj@yahoo.com.cn).

ObjectiveTo prepare and study the biocompatibility of Hydroxybutyl chitosan(HBC)with mouse embryonic fibroblasts(MEF)in vitro.To investigate the feasibility of using HBC as tissue engineering materials.MethodsThe HBC were prepared by chitosan chemically modified and the best preparation conditions were summarized.Different solvents were used on HBC for the solubility test.The structure of the HBC was characterized by IR and scanning electron microscopy (SEM).MEFs were isolated and cultivated from mouse embryo.The biocompatibility of HBC is investigated by using the MTT assay.ResultsAll the four HBC samples could dissolve in water and HBC 4 which was acted 14 hours at 55℃have better water-solubility.HBC solution can rapidly transform to semisolid at body temperature(37℃)and revert to its solvated state by physical crossliking at lower temperature.MEF cultured with four kinds of leachates of HBC were investigated by the MTT assay and the cytotoxicity of HBC was in graded 0 and 1.ConclusionHBC was prepared successfully with good thermosensitivity and could be transformed into gelation at body temperature(37℃).HBC presented good biocompatibility with MEFs and could be used as tissue engineering materials.

Hydroxybutyl chitosan;Mouse embryonic fibroblasts;Thermosensitive hydrogel;Tissue engineering

Q813.1+1，R318.08

A

1673－0364（2011）02－0085－04

2010年12月26日；

2011年1月20日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.02.006

230022安徽省合肥市安徽医科大学第一附属医院整形外科（孙伟，赵宇，汪春兰）；230026安徽省合肥市中国科学技术大学（季翔，汪谟贞，方月娥）。

汪春兰（E-mail:wangchunlan9@163.com）；赵宇（E-mail:zhaoyuzj@yahoo.com.cn）。