阿托伐他汀对糖尿病ApoE基因敲除小鼠组织中CD55和CD59表达的影响

马西文 秦明照 赵焕英 常志文 张 勇 宋爱丽

1)河南大学附属郑州市第一人民医院内分泌老年病科 郑州 450004 2)首都医科大学附属北京同仁医院 北京 100730 3)首都医科大学 北京 100069

糖尿病性脑血管病包括颅内大血管病变和微血管病变,颅内大血管病变的主要病理学改变为动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)。AS进程加速是糖尿病患者致死致残的主要原因。他汀类药物是目前临床应用广泛、有效的抗AS药物。除调脂作用外,他汀类药物还具有减轻炎症、抗氧化、改善血管内皮功能、抑制细胞增殖和免疫调节等多种作用[1]。体内外研究发现,他汀类药物能够上调CD55和(或)CD59表达[2-3]。但在糖尿病大血管病变组织中,他汀类药物对CD55和CD59表达的影响尚不清楚。

本研究通过ApoE基因敲除(ApoE knock out,ApoE-/-)小鼠建立糖尿病动脉粥样硬化动物模型,运用免疫荧光和实时定量聚合酶链反应技术,观察阿托伐他汀对糖尿病动脉粥样硬化小鼠主动脉组织中补体调节蛋白CD55和CD59表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:雄性6周龄C57BL/6遗传背景的ApoE-/-小鼠22只,平均体质量(21.27±2.52)g,购自于北京大学医学部实验动物科学部(SPF/VAF级,许可证号:SCXK(京)2006-0008)。动物饲养场地:首都医科大学附属北京口腔医院动物室(SPF级,许可证号:SYXK(京)2005-0031)。普通鼠饲料购于军事医学科学院实验动物中心(SPF级,许可证号:SCXK(军)2007-005)。

1.1.2 试剂:一抗:CD55(s-15),美国Santa Cruz公司,批号B2105;CD59(FL-123),美国Santa Cruz公司,批号C1606。二抗:TRITC-兔抗山羊IgG(H+L),北京中杉金桥生物技术有限公司,批号76925;FITC-猪抗兔IgG,丹麦Dako公司,批号C00032594。

1.2 方法

1.2.1 建立糖尿病动脉粥样硬化模型[4]:将22只雄性6周龄ApoE-/-小鼠饲养于室温25℃、12/12 h光照/黑暗交替环境中,每笼5只,普通饲料喂养,自由进食水。适应1周后,建立糖尿病动脉粥样硬化动物模型。步骤如下:将小鼠编号、称重,按55 mg◦kg-1◦d-1体质量计算链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)用量(Sigma S0130,美国Sigma-Aldrich公司,批号071K7604),1次/d,连续5 d腹腔注射。1周后剪尾法取血测血糖,血糖值＞11.1 mmol/L即为造模成功[5]。22只小鼠20只造模成功,2只小鼠血糖＜11.1 mmol/L弃去不用。

1.2.2 实验动物分组及给药方案:分为2组,糖尿病动脉粥样硬化(对照)组10只,蒸馏水灌胃;阿托伐他汀干预(干预)组10只,阿托伐他汀(中美辉瑞制药有限公司惠赠)灌胃(10 mg◦kg-1◦d-1体质量)[6]。

1.2.3 标本采集及检测:药物干预8周后,据体质量给予1%戊巴比妥钠(50 mg◦kg-1体质量)腹腔注射麻醉处死。采用摘眼球法取血,取血前全部小鼠禁食水3小时[5]。获取血标本,应用Unicel DxC 800型全自动生化分析仪(美国Beckman公司)测定血脂,ELISA试剂盒检测小鼠血清淀粉样蛋白-A(serum amyloid-A,SAA)水平(美国Rapid Bio公司,批号23050802);剪尾法取血,采用罗氏血糖仪(德国Roche公司)检测血糖水平。观察动脉粥样硬化病变情况,计算斑块面积大小,比较阿托伐他汀干预前后CD55和CD59蛋白水平及mRNA水平表达变化。

1.2.4 计算动脉粥样硬化斑块面积[7]:每组5只小鼠留取主动脉全长,显微镜下纵剖。常规苏丹Ⅳ染色后,×4倍镜下实域分割,每条主动脉取6个视野,经Daheng Imavision HV Camera Performance图像采集系统采集图像,使用M otic 6.0数码医学图像分析软件测量斑块面积。尺寸定标值1 μ m,光密度定标值255,计算平均斑块面积。

1.2.5 免疫荧光检测小鼠主动脉组织CD55和CD59蛋白表达:每组5只小鼠留取主动脉弓组织,-20℃连续切片,厚度7 μ m,每隔4张取片1张,共4张。置-20℃冰丙酮中固定5 min,室温晾干;入无水乙醇中5 min,室温晾干;PBS水洗3次;用3%正常兔血清室温封闭1 h;移去封闭液,滴加一抗:CD55(浓度1∶200)和CD59(浓度1∶200),置于湿盒内,4℃过夜;PBS水洗3次;滴加二抗:TRITC-兔抗山羊IgG(H+L)(浓度1∶50)和FITC-猪抗兔IgG(浓度1∶20),避光置于湿盒内,室温1 h;避光PBS水洗3次;90%甘油/PBS封片。采用DM4000B型显微镜(德国Leica公司)观察CD55和CD59蛋白表达。

1.2.6 Real-time PCR检测小鼠主动脉组织CD55和CD59 mRNA表达:Trizol试剂(美国Sigma-Aldrich公司,批号116K1801)抽提总RNA,DU800型紫外分光光度仪(美国Beckman Coulter公司)测OD值(260 nm/280 nm)及浓度;采用First Strand cDNA合成试剂盒(英国BioLabs公司,产品号E6500s)逆转录为cDNA;使用引物设计软件Primer express 3.0(美国ABI公司)设计引物,序列为:CD55:上游(87-106)5'-CCCAACTGTACGCGGAGACT-3',下游(148-130)5'-CCAAGATTGGCCTGGCAT T-3';CD59:上游(114-134)5'-GCTGCT TCTGGCTGTGTTCTG-3',下游(175-153)5'-GTTGGAAACAGTGGTAGCATGTG-3';GAPDH:上游(684-703)5'-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3',下游(738-722)5'-GCGGCACGTCAGATCCA-3'。

按下列比例配制反应体系:SYBR Green(英国ABI公司,批号0412165)10μ L,上下游引物的混合液1 μ L,cDNA模板1 μ L,去酶水8μ L,总量20 μ L;将配好的反应体系上机反应(ABI7300,美国ABI公司)。反应条件:95℃,5 min;95℃,15 s;57℃,30 s;72℃,30 s。共60个PCR循环。扩增反应结束后建立PCR产物熔解曲线。

1.3 统计学分析 计量资料用均数±标准差表示,非正态资料经对数转换。组间比较用独立样本t检验。全部数据采用SPSS for Windows 11.5统计软件,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般指标和动脉粥样硬化斑块面积比较 与对照组相比,阿托伐他汀干预后体质量增加[(18.2±1.7)g vs.(27.9±1.1)g,P=0.000],血糖水平差异无统计学意义[(29.4±4.2)mmol/L vs.(24.6±7.4)mmol/L,P=0.240,P＞0.05]。血脂方面,阿托伐他汀干预后2组总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白水平差异无统计学意义[(18.4±1.75)mmol/L vs.(31.6±17.0)mmol/L,(1.0±0.3)mmol/L vs.(1.1±0.5)mmol/L,(14.6±2.0)mmol/L vs.(23.4±13.3)mmol/L,(6.3±0.6)mmol/L vs.(8.9±4.9)mmol/L,P值分别为0.120、0.706、0.179、0.287,P均＞0.05]。阿托伐他汀干预后SAA水平有减少趋势[(3.8±1.6)μ g/mL vs.(5.9±3.2)μ g/mL,P=0.230,P＞0.05]。同样,平均动脉粥样硬化斑块面积也呈下降趋势[(218752.4±87927.16)μ m2vs.(264046.4±88374.97)μ m2,P=0.221,P＞0.05]。

2.2 小鼠主动脉组织中CD55和CD59蛋白水平比较 用免疫荧光染色观察小鼠主动脉组织中CD55和CD59表达情况,可见CD55和CD59主要表达在血管内皮层。与对照组相比,阿托伐他汀干预8周后,CD55和CD59蛋白表达强度均有增强。见图1、2。

2.3 各组小鼠主动脉组织中CD55和CD59 mRNA水平表达 每组5只小鼠留取胸和腹主动脉组织行Real-time PCR检测。与对照组相比,阿托伐他汀干预8周后,2组CD55和CD59 mRNA相对表达量无明显变化(0.55±0.2 vs.0.43±0.11,0.76±0.36 vs.0.55±0.13,P值分别为0.616、0.605,P均＞0.05)。

3 讨论

补体系统活化有三条途径:经典途径、旁路途径和甘露聚糖结合凝集素途径。三条途径活化后形成C3/C5转化酶,最终产生膜攻击复合物导致靶细胞溶解。然而,除了溶细胞效应,补体级联反应对自身组织也可造成潜在的损伤。CD55和CD59是膜结合的补体调节蛋白,CD55作用于C3/C5转化酶,CD59阻止膜攻击复合物装配形成,从而保护自身细胞免受补体的损伤。

糖尿病大血管病变主要发生在心、脑及下肢,是糖尿病患者死亡的主要原因,基本病理变化是动脉粥样硬化。美国心脏保护研究(heart protection study,HPS)结果显示,他汀类药物治疗能使糖尿病卒中、冠心病和血管重建的危险性下降34%。他汀类药物是目前临床应用广泛有效的调脂药物。除调脂作用外,他汀类药物还具有减轻炎症、抗氧化、改善血管内皮功能、抑制细胞增殖和免疫调节等多种作用[1]。前期研究发现[8],糖尿病大血管病变患者外周血白细胞CD55和CD59表达下调;同时,他汀类药物有上调外周血白细胞CD55和CD59表达的趋势。但他汀类药物对糖尿病大血管病变组织中CD55和CD59表达的影响尚未见报道。

具有C57BL/6遗传背景的ApoE-/-小鼠,可以在喂食普通饲料情况下,15周龄时形成复杂的AS病变,其斑块分布及病理特征与人类AS斑块极为相似[9];给予ApoE-/-小鼠多次小剂量腹腔注射链脲佐菌素,成模后6周,在主动脉弓及胸主动脉主要分叉处可形成明显的AS纤维斑块病变,是研究糖尿病动脉粥样硬化较好的动物模型[10]。给予ApoE-/-小鼠喂养普通饲料,连续5次腹腔注射STZ,成模8周后处死。结果显示,糖尿病动脉粥样硬化组体质量减轻,血脂增高,主动脉根部至主动脉弓AS病变面积增大。免疫荧光显示,小鼠CD55和CD59主要表达在主动脉内膜和外膜,中膜未见明确表达,与文献报道结果相似[11]。

他汀类药物是3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A(hydroxymethyl-glutaryl coenzyme A,HMG-CoA)还原酶抑制剂,主要用于控制血脂水平。体外研究发现,他汀类药物能诱导CD55表达[2];在高脂血症患者体内,他汀类药物上调了外周血白细胞CD59表达[3]。为观察他汀类药物对糖尿病动脉粥样硬化组织中CD55和CD59表达的影响,本研究给予小剂量阿托伐他汀干预8周,结果显示,与糖尿病动脉粥样硬化组相比,他汀组血脂水平无明显降低,SAA水平和AS病变面积有下降趋势,主动脉组织中CD55和CD59蛋白表达强度增强,mRNA水平无变化。提示阿托伐他汀可上调小鼠主动脉组织中CD55和CD59蛋白水平的表达。

近年来研究表明,他汀类药物具有许多降脂以外的作用,包括抗炎、改善血管内皮功能、抗氧化、抑制心肌细胞凋亡、稳定AS斑块等[1]。炎症因子、细胞凋亡均可活化补体,导致补体调节蛋白的下调。本研究发现,阿托伐他汀干预后炎症因子SAA水平下降,可能是上调CD55和CD59蛋白水平表达的原因之一;阿托伐他汀干预后AS斑块面积减少,但差异无统计学意义,可能与样本量较少有关。此外,体外研究发现[2],他汀类药物可通过PKCa介导的途径和抑制RhoA上调CD55的表达来达到早期抗AS的目的,但糖尿病患者AS进程加速。在高血糖状态下他汀类药物上调补体调节蛋白的机制有无变化值得进一步研究。

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