替考拉宁对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和敏感菌药敏实验的研究

毛理纳,刘 娜,罗 予

(1.河南职工医学院医学系,河南郑州 451191; 2.郑州大学医药科学研究院,河南郑州 450052)

金黄色葡萄球菌为临床常见致病菌,随着抗生素的广泛应用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的检出率也逐年增高,国内近年来报道的MRSA分离率也在60%～70%[1]。MRSA菌株具有多重耐药性,它对现今所有的β-内酰胺类药物耐药,目前临床上治疗MRSA感染的首选药是万古霉素、替考拉宁等糖肽类抗生素[2]。替考拉宁对 MRSA的治疗作用比万古霉素强大,不良反应少于万古霉素且与氨基糖苷类联用对肾功能损害较轻微。该文探讨替考拉宁对MRSA和敏感葡萄球菌(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus,MSSA)临床分离株的体外抗菌活性,为临床治疗金黄色葡萄球菌尤其是MRSA的感染,提供用药及耐药监测依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 郑州大学第一附属医院临床感染标本分离得到,且不重复的 18株金黄色葡萄球菌,质控标准菌株为金黄色葡萄球菌ATCC 25923。

1.1.2 药品 替考拉宁(浙江医药股份有限公司新昌制药厂,批号:090203)。

1.1.3 PCR试剂盒 天根生化科技有限公司。

1.1.4 MH肉汤 北京三药科技开发公司,批号: 0810282。药敏纸片:北京天坛药物生物技术开发公司。

1.2 方法

1.2.1 mecA基因PCR检测 引物序列如下[3]: P1:5'-TGGCTATCGTGTCACAATCG-3',P2:5'-CTGGAACTTGTTGAGCAGAG-3'。由宝生物工程有限公司合成。

PCR扩增片段长度为310 bp。采用煮沸法提取基因组DNA,PCR反应总体系为50 ul,PCR反应条件:94℃变性3 min;PCR循环(94℃50 s,55℃50 s,72℃70 s,32个循环),72℃延伸 5min。然后用0.8%琼脂糖凝胶电泳,进行扩增产物鉴定。

1.2.2 临床菌株的头孢西丁纸片法检测MRSA

按照K-B纸片扩散法进行,根据抑菌圈直径大小判断细菌的耐药情况。根据2006年NCCLS判定标准判定[4]:MRSA抑菌环直径≤19 mm,MSSA抑菌环直径≥20mm。

1.2.3 替考拉宁对金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性 琼脂稀释法:将已倍比稀释的不同浓度替考拉宁溶液分别加入已加热溶解并在 50℃水浴中平衡的MH琼脂中,充分混匀后倾入灭菌平皿中,按(药物∶琼脂=1∶9)比例配制药物琼脂平板。

菌液制备与接种:取过夜培养各菌株增菌液用无菌生理盐水稀释 100倍,调整菌含量为每毫升106个细菌,备用。

用接种器吸取制备好的菌液约 2μl接种于含药琼脂平板表面,置 37℃孵育 24 h,观察结果。根据2006年NCCLS判定标准判定:耐药菌MIC≥32 mg·L-1,敏感菌MIC≤8mg·L-1。

2 结果

2.1 mecA基因PCR检测结果 18株金黄色葡萄球菌临床分离株中9株检出mecA基因,为MRSA阳性,阳性率为50%,9株未检出mecA基因。见图1和 2。

2.2 头孢西丁纸片法检测结果 9株MRSA的抑菌环直径均小于19mm。余9株菌的抑菌环直径均大于20mm,为MSSA。

2.3 替考拉宁对MRSA/MSSA体外MIC测定结果替考拉宁对金黄色葡萄球菌ATCC25923的MIC为0.125 mg·L-1,对9株MRSA的MIC在1～2 mg·L-1,对9株MSSA的MIC在0.125～0.25 mg·L-1。对替考拉宁均为敏感。

3 讨论

替考拉宁对MRSA和MSSA的药敏结果显示,替考拉宁对二者均有良好的抗菌活性,但MRSA的MIC大于MSSA的MIC,最低抑菌浓度均在有效浓度范围之内,可以作为MRSA感染的治疗药物。近年来,随着抗生素及糖皮质激素的应用,细菌耐药问题日益严重。据文献报道,90%以上的葡萄球菌(SA)可产β-内酰胺酶使青霉素类抗生素水解失活,表现为耐药。1961年英国报道了首例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)以来,迅速在全球范围内播散,其所致的医院感染率逐渐上升,并开始向社区播散,成为全球关注的严重感染疾病[5]。本文中,18株金黄色葡萄球菌中9株为MRSA,MRSA的分离率为50%。MRSA从未知宿主中获得一种MecA基因,编码产生新的PBPs,即PBP2a。PBP2a为一种转肽酶,对抗菌药亲和力低,能代替PBPs继续肽聚糖合成以维持SA的生长、成活,表现为高度耐药。MRSA几乎是多重耐药菌,对所有β-内酰胺类抗生素耐药,甚至累及到红霉素、环丙沙星、庆大霉素。目前MRSA仅对糖肽类(万古霉素、替考拉宁)抗生素和某些新研制的抗菌药如唑烷酮类(利奈唑胺)敏感 。

替考拉宁在临床上主要用于治疗各种革兰阳性菌引起的严重感染,尤其对MRSA引起感染的治疗作用比万古霉素更强大,严重不良反应罕见,除静脉给药外也可进行肌内注射等优点。该实验通过替考拉宁对金黄色葡萄球菌体外抗菌活性研究,为临床治疗MRSA感染性疾病提供用药及耐药监测依据。

[1] 董 燕,王仙园,周 红,等.中草药对MRSA临床株的抑菌作用研究[J].护理研究,2008,22(4):863-865.

[2] Lowy FD.StaphyLococcus intecLions[J].NEng LMed,1998,339 (8):520-532.

[3] 樊 新,岳乔红,杨 柳,等.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MecA基因的鉴定分析 [J].现代检验医学杂志,2007,22 (6):66-67.

[4] Clinical and Laboratoty Standards Institute.Perfor2mance standards for antimicrobial suscep tibility testing[S].M1002S15, CLSI,2006.

[5] Enng MC,Robinson DA,Randle G,etal.The evolutionary history ofmethicillin resistant staphylococcus aureus(MRSA)[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(11):7 687-7 692.