MP对大鼠脊髓损伤后HSP 27表达的影响

周亚洲,贾梦瑞,王文刚

(河南职工医学院外科教研室,河南郑州 451191)

脊髓损伤常规分为原发性损伤和继发性损伤。减少继发性损伤,及时彻底地减压和恢复脊柱稳定性是目前治疗脊髓损伤的主要办法。机体在脊髓损伤后具有一定的自我保护修复能力,可以在损伤的局部分泌一些保护性的因子,热休克蛋白27(HSP 27)即为其中之一。甲基强的松龙(methylprednisolone,MP)为目前公认的治疗急性脊髓损伤的有效药物之一,但是其作用机理仍未十分明了。王文刚、夏磊等通过检测大鼠脊髓损伤后24 h时HSP 27表达程度,证明HSP 27表达的增强对受损的脊髓神经细胞可能起到较好的保护作用从而在病理形态学上出现相应的损伤较轻的改变[1]。该实验将在其实验基础上通过检测脊髓损伤后 6 h,8 h,16 h, 24 h,48 h,7 d热休克蛋白表达状况,对脊髓损伤早期应用MP后HSP 27的表达变化进行更为完善的研究,进而探讨其临床意义。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组 健康成年Sprague-Daw ley大鼠(郑州大学实验动物中心提供)90只,质量200 ±20 g。随机分成3组:A组(正常组)30只,术后即从大鼠尾部静脉注射氯化钠注射液 0.5 ml,仅行椎板切除但不损伤脊髓;B组(对照组)30只大鼠,术后即从大鼠尾部注射氯化钠注射液 0.5ml,椎板切除后给予脊髓损伤打击;C组(MP组)30只大鼠,甲基强的松龙用药量为 30 mg·kg-1,用氯化钠注射液稀释至0.5m l,术后即从大鼠尾部静脉注射,椎板切除后给予脊髓损伤打击。

1.2 麻醉与手术 2.5%戊巴比妥钠溶液对大鼠进行腹腔注射麻醉。大鼠俯卧位固定于平板上,常规消毒,以T8棘突为中心取后背正中纵形切口,咬除T8、T9的棘突及椎板,暴露 T8、T9平面脊髓。用直径0.5 cm,重10 g的钢棒,从5 cm高处垂直落下打击致脊髓损伤。术中见鼠尾痉挛性摆动,双下肢及躯体回缩扑动,双下肢瘫痪,如此视为手术成功。

1.3 病理标本取材 实验动物麻醉后用4%多聚甲醛全身灌注,后取损伤脊髓远端 0.5 cm处脊髓,长2 cm,常规甲醛固定,脱水,石蜡包埋,切片厚16μm,HE染色。

1.4 免疫组织化学染色和图像分析 按HSP 27试剂盒操作说明(试剂购于北京中杉金桥生物有限公司)操作。采用上海富科光学仪器有限公司的Bioseens Digital Imaging System图像分析系统测量阳性染色物质吸光度:每张片随机选取 6个不同视野, 400高倍镜下用计算机计算出平均吸光度值 A,A反应染色强度,代表相对含量。

1.5 统计学处理 用SPSS 13.0统计分析软件处理实验数据,所有数据均用均数±准差(±s)表示,组间采用t检验。

2 结果

2.1 脊髓大体观及镜下观 正常组:灰白质交界清楚,神经元丰富,胞体大核仁明显,前角灰质及近中央管可见微小血管;对照组:打击处肿胀,脊膜下出血,灰白质界限不清。光镜下见脊髓局灶性出血,神经元和细胞核浓集,染色增强,并逐渐出现神经元固缩、坏死、溶解,细胞体积变小,有大量的小胶质细胞浸润。白质中髓鞘肿胀、水肿,有炎细胞浸润;甲基强的松龙组:脊髓肿胀、出血较对照组轻,灰白质界限清楚。光镜见脊髓损伤轻,髓鞘肿胀明显,神经元大体正常。

2.2 免疫组织化学染色及图像分析 通过免疫组织化学染色处理,HSP 27为电镜下棕黄色阳性颗粒,结果显示:MP组颗粒最多,染色最深;其次为对照组,而正常组则颗粒最少,染色最浅。通过计算机图像分析,计算出MP治疗组的平均吸光度值也较对照组和正常组大。

表1 3组术后HSP 27平均光密度值(±s)

表1 3组术后HSP 27平均光密度值(±s)

注:与A组、B组比较,1)P＜0.05。

组别 6h 24 h 7 d A组 4.3±0.2 2.4±0.7 1.0±0.2 B组 29.4±5.6 3.5±1.3 1.4±0.5 C组 76.5±4.31) 91.5±6.41) 80.2±4.31)

3 讨论

3.1 MP保护受损中枢神经、促进其再生的用药剂量和给药时间的探讨 MP用于脊髓损伤治疗的试验最早开展于 20世纪 80年代初期,当时使用了所谓的大剂量(1 000mg)来治疗(NASCISⅠ),但无效果;1990年美国第2次全国急性脊髓损伤研究(NASCISⅡ)结果报告:用大剂量MP在伤后8 h内,首先以30 mg·kg-1静脉内快速冲击,继之以5.4mg/kg/h维持23 h,通过6周6个月1 a随访, 8 h内用MP治疗的患者与对照组相比其运动和感觉功能恢复有显著增加,但伤后 8 h后再给药不能逆转神经元的变性。1997年NASCISⅢ结果进一步表明,ASCI患者在损伤3 h内应用MP治疗应维持24 h,损伤 3～8 h应用MP治疗应维持治疗48 h[2]。本实验MP用量30mg·kg-1,脊髓损伤5 min后从大鼠尾静脉给药与文献报道相符。

3.2 脊髓细胞病理形态学变化和HSP 27表达增强的重要意义 在本实验中,与正常组和对照组相比, MP治疗组出血及组织水肿较少,胞浆空泡化及核固缩减少,白质水肿、空泡变性也较轻,神经元数目也较多。在HSP 27的表达上,实验组较对照组阳性染色颗粒较多、染色也较深,统计学上也有显著差异(P＜0.05),说明HSP 27表达的增强对受损的脊髓神经细胞可能起到较好的保护作用从而在病理形态学上出现相应的损伤较轻的改变。在理论上从一个方面支持了MP对受损脊髓细胞起到了较好的保护作用。

3.3 MP早期应用保护受损的脊髓神经细胞可能的作用机制 MP在静脉注射后约15～30 min可达血浆峰浓度,给药 30min后,脊髓损伤或非损伤部位出现峰浓度。在损伤后 1 h内给药,损伤部位摄入的MP明显比非损伤部位多,而损伤1 h后给药,损伤部位MP摄入明显随损伤时间下降,与非损伤部位没有显著差异。这说明早期使用MP才能产生效果。由于MP本身是难溶于水的,所以临床上使用的是甲基强的松龙琥珀酸钠,它可溶解于水。进入体内后,通过肝脏胆碱酯酶的水解作用,甲基强的松龙琥珀酸钠水解成游离型MP,游离型的MP才能通过血脑屏障发挥其神经保护作用[3]。

3.4 脊髓损伤后HSP 27的表达及MP对其表达的影响 HSP 27是热休克蛋白中较为保守的一类。在应激状态下,HSP 27与ATP结合后与变性蛋白多肽结合,通过 ATP释放出的能量来解开多肽链的错误折叠,使其再次成为正常蛋白从而使细胞的功能和结构恢复。HSP 27是p38MAPK代谢的终末产物,在细胞内可表现为单体/二聚体甚至 700 kD的寡聚体,分子内C端的连接形成稳定的二聚体,N末端的进一步连接使二聚体再形成多聚体[4]。HSP 27主要参与微丝的稳定和细胞信号转导。HSP 27能阻止应激状态的肌动蛋白和微丝的分裂,有利于细胞骨架的稳定,它不仅对单个细胞产生应激耐受起重要作用,而且通过内皮和上皮的屏障,对整个机体起必要的保护作用[4～6]。

在众多的实验中发现脊髓损伤后会出现HSP 27的表达,而且HSP 27表达强弱和持续时间与损伤时间长短有关。本实验在正常组中几乎没有HSP 27表达。对照组则在 6 h、8 h时有轻微的HSP 27胞质表达,同时细胞有轻微结构改变;至 24 h则基本没有表达,同时细胞结构不清,明显肿胀。而MP组在6 h、8 h、16 h、24 h、48 h、7 d均有明显HSP 27胞质和细胞核表达,细胞结构没有明显改变。该实验结果证明MP可以诱导HSP 27表达及延长表达时间。最近的研究表明HSP 27作为RNA结合因子可以指导随后的mRNA降解和翻译过程中RNA底物的恰当折叠,从而进一步调控功能性结构蛋白;而在细胞核中HSP 27表达增加了同非蛋白分子(如mRNA等)的相互作用机会。因此虽然HSP 27在胞质和胞核中表达提前和延长并不是脊髓损伤后神经元自我保护的唯一原因,但笔者认为其表达尤其在胞核中的表达在脊髓损伤修复中可能起到重要作用。

[1] 王文刚,夏 磊,等.早期应用甲基强的松龙上调受损脊髓细胞内hsp27蛋白的表达[J].医药论坛杂志,2007,28(3):13-15.

[2] Bracken MB,Holford TR.Neurological and functional status 1year after acute spinal cord injury:estimates of functional recovery in National Acute SpinalCord Injury Study II from resultsmodeled in National Acute Spinal Cord Injury StudyⅢ[J].J Neurosurg, 2002,96(3 Suppl):259-266.

[3] Braughler JM,Hall ED.Uptake and elim ination ofmethylprednisolone from contused cat spinal cord following intravenous injection of the sodium succinate ester[J].JNeurosurg,1983,58(4): 538-542.

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