H9c2细胞对B组柯萨奇病毒3型重组株的易感性

林乐勋，赵文然，武帅钦，佟雷，王燕，张凤民，钟照华

1. 哈尔滨医科大学病原生物学实验教学中心，哈尔滨 150081； 2. 哈尔滨医科大学微生物学教研室，黑龙江省感染与免疫重点实验室，哈尔滨 150081； 3. 哈尔滨医科大学细胞生物学教研室，哈尔滨 150081

H9c2细胞是来源于胚胎期BD1X大鼠心脏组织的亚克隆细胞系，表现很多骨骼肌细胞的特性[1]。当H9c2细胞汇合时，细胞就会融合成多核的肌管并对乙酰胆碱刺激有反应，但该细胞缺少像心肌细胞一样的节律性搏动；此外，多项生化、电生理指标的检测也表明其具有骨骼肌的很多特点[1]。由于来源于心脏，H9c2细胞作为心脏成肌细胞也用于心肌疾病的研究[2,3]。

B组柯萨奇病毒(group B Coxsackievirus，CVB)是病毒性心肌炎和心肌病的主要病原体[4]。CVB可在容许细胞中迅速复制，并通过杀伤宿主细胞释放出来。H9c2细胞能否被CVB感染，并作为体外细胞模型应用于CVB致心肌疾病的研究，目前未见报道。本研究采用整合了增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)或海肾荧光素酶(Renillaluciferase，RLuc)的CVB3重组株EGFP-CVB3、RLuc-CVB3攻击H9c2细胞及小、大鼠原代心肌细胞和骨骼肌细胞，观察H9c2细胞对CVB3的易感性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物BALB/c乳鼠、Sprague-Dawley (SD)大鼠(出生4 d内)，均购自哈尔滨医科大学实验动物中心。

1.1.2细胞、病毒H9c2和 HeLa细胞购自美国ATCC；CVB3H3为哈尔滨医科大学微生物学教研室保存，EGFP-CVB3和RLuc-CVB3由本课题组构建[5]并保存。

1.1.3主要试剂细胞培养液为DMEM，pH 7.2～7.4，使用时加入10%胎牛血清(fetal calf serum，FCS)和1%双抗。消化液为0.25%胰蛋白酶及0.5%胰蛋白酶与0.04% EDTA的混合液(1∶1)。TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；RLU检测试剂盒(RenillaLuciferase Assay System)E2820购自Promega公司；SYBR®PrimeScriptTMRT-PCR KitⅡ试剂盒DRR083A购自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1H9c2细胞培养按常规贴壁细胞培养方法进行培养，2～3 d传代1次。

1.2.2原代骨骼肌细胞或心肌细胞培养处死出生4 d内的BALB/c乳鼠或SD乳鼠，分别取四肢肌肉和心脏，用37 ℃预温的D-Hanks液洗1～2次，剪成体积为1 mm3的小块；用0.25%胰酶37 ℃水浴消化10 min，将消化的细胞悬液吸出，加入含有15% FCS和1% 双抗的DMEM 终止消化，4 ℃保存；如此循环5～7次，至组织块完全消化。将收集好的骨骼肌细胞 1 500 r/min 离心7 min，弃上清液，用培养液重悬、过滤后收集细胞到培养瓶中或接种到孔板中，置37 ℃、5% CO2孵箱中培养。

1.2.3CVB3H3、EGFP-CVB3和RLuc-CVB3毒力测定采用空斑形成试验测定各毒株毒力，接种于HeLa细胞，纯化、扩增病毒。

1.2.4EGFP-CVB3和RLuc-CVB3感染H9c2细胞、HeLa细胞、骨骼肌细胞和心肌细胞当细胞长至60%～70%时，弃培养液，将稀释好的1个感染复数(multiplicity of infection, MOI)的病毒接种到细胞中，37 ℃、5% CO2孵箱中孵育1 h；弃病毒液后，加入适量培养液继续培养。

1.2.5绿色荧光观察及流式细胞计数检测每天用荧光显微镜观察感染的各种细胞中EGFP表达情况，并用500 μl感染或未感染EGFP-CVB3的HeLa或H9c2细胞(约1×106个细胞)进行流式细胞计数，分析感染后表达EGFP的细胞数。分离的细胞采用2%聚合甲醛进行固定。通过FC 500MPL流式细胞仪(Beckman，USA)计数10 000个细胞进行分析，数据用CellQuestTMPro(BD Biosciences, USA)进行处理。

1.2.6RLuc表达水平检测以未感染的H9c2细胞和HeLa细胞为对照，按照RLU检测试剂盒试剂说明书，用20/20n光度计对RLuc-CVB3感染的H9c2细胞和HeLa细胞进行RLuc测定。

1.2.7病毒核酸的反转录-聚合酶链反应检测RLuc-CVB3感染H9c2细胞后，用TRIzol试剂提取培养在6孔板中的细胞总RNA，并针对CVB3 5′非编码区(untranslated region，UTR)进行反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)[6]。扩增CVB3的上、下游引物分别为：GACTTGATCCC-ACCCACAGGGCCTAT和GACGCTCTATTA-GACACCGGATGGCC，扩增片段大小为638 bp；扩增β-actin的上、下游引物分别为：AGGGAAA-TCGTGCGTGAC和CTGGAAGGTGGACAGT-GAG，扩增片段大小为444 bp。在0.2 ml微量离心管中加入反转录反应体系：下游引物(5′ UTR或β-actin)1.0 μl，RNA模板1.0 μl，5×Prime Script Buffer 2.0 μl，DEPC处理的ddH2O 5.5 μl，Prime Script RT Enzyme MixⅠ0.5 μl，总体积为10 μl。放入PCR仪中37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃终止反应。PCR反应体系：模板0.5 μl(50 ng)，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μl，2.5 mmol/L dNTP混合物4.0 μl，10× LA PCR BufferⅡ(含Mg2+)5.0 μl，LATaqDNA 聚合酶(5 u/μl)0.5 μl，ddH2O 38 μl。反应条件为：95 ℃ 预变性5 min；95 ℃变性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循环30次；72 ℃充分延伸8 min。

2 结果

2.1 CVB3H3、 EGFP-CVB3和RLuc-CVB3感染的结果

空斑形成试验测定CVB3H3和重组病毒株EGFP-CVB3、RLuc-CVB3的毒力，结果分别为2×108pfu/ml、1.17×108pfu/ml 和1.4×107pfu/ml。两重组株均具有较强的毒力，但由于插入外源基因片段的大小不同，毒力略低于原型株。易感的HeLa细胞被感染时可见明显的细胞病变效应，即细胞皱缩、变圆、聚集、脱落，甚至死亡(图1)。

2.2 EGFP-CVB3感染后EGFP的检测

以MOI=1的EGFP-CVB3进行攻击，用荧光显微镜观察。结果显示，与其他细胞相比，H9c2细胞EGFP产生情况与原代大鼠骨骼肌细胞相似，即在感染后2～5 d原代大鼠骨骼肌细胞和H9c2细胞中均未见EGFP；与正常对照组相比，细胞正常生长，未见细胞病变效应。而在原代小鼠心肌细胞、小鼠骨骼肌细胞和大鼠心肌细胞中都可见EGFP；与正常对照组细胞相比，产生EGFP的细胞部分出现皱缩、变圆等细胞病变效应(图2)。

HeLa cells were challenged with CVB3H3, EGFP-CVB3, and RLuc-CVB3 (MOI=1). The cytopathic effect was observed under light microscope at 24 h post-infection. A: HeLa cells. B: HeLa cells infected with CVB3H3. C: HeLa cells infected with EGFP-CVB3. D: HeLa cells infected with RLuc-CVB3.

图1CVB3H3、EGFP-CVB3和RLuc-CVB3感染HeLa细胞的结果

Fig.1ResultsofHeLacellsinfectedwithCVB3H3,EGFP-CVB3,andRLuc-CVB3

Primary culture of cardiac myocytes of BALB/c mouse (mCM) and SD rat (rCM), skeletal myocytes of BALB/c mouse (mSM) and SD rat (rSM) as well as H9c2 cells were challenged with EGFP-CVB3 (MOI=1). EGFP expression was observed under 488 nm excitation at 2 to 5 d post-infection. LM, light microscopy; FM, fluorescent microscopy; NC, normal cells; VC, cells infected with EGFP-CVB3.

图2EGFP-CVB3感染各种细胞后2～5d荧光观察结果

Fig.2EGFPexpressioninvariouscellsinfectedwithEGFP-CVB3(MOI=1)at2to5dpost-infection

以未感染的H9c2和HeLa细胞为对照，流式细胞仪计数以MOI=1的EGFP-CVB3攻击后感染细胞表达EGFP的细胞数。结果表明，感染的H9c2和HeLa细胞荧光(fluorescence light，FL)/边散射(side scatter，SS)的模式完全不同(图3A)。同时荧光显微镜下可见病毒感染的HeLa细胞出现明显皱缩、变圆、脱落等细胞病变效应，病变细胞产生绿色荧光；而病毒感染的H9c2细胞与正常H9c2细胞相比，形态并无明显差别，感染后7 d也未见细胞病变效应及特异的绿色荧光(图3B)。

2.3 RLuc-CVB3感染后RLuc的检测

将MOI=1的RLuc-CVB3感染H9c2细胞和HeLa细胞，间隔1 d或2 d进行RLuc检测(n=4)。结果表明，与感染的HeLa细胞相比，感染的H9c2细胞保持较低水平的RLuc表达，直至感染后第14 天(图4)。

To compare the green fluorescence in H9c2 cells and HeLa cells infected with EGFP-CVB3, 70% confluent H9c2 cells and HeLa cells were infected with EGFP-CVB3 (MOI=1). The cells were counted by flow cytometry and fluorescent microscopy at intervals of 2 to 3 d. HeLa cells were checked only for 2 d because the cells were killed thereafter. The X-axis represents fluorescence light (FL) in Log. The Y-axis represents side scatter (SS). The patterns of FL/SS were completely different between H9c2 cells and HeLa cells. A: Flow cytometry. B: Fluorescent microscopy. p.i., post-infection.

图3EGFP-CVB3感染的H9c2和HeLa细胞中绿色荧光比较

Fig.3ComparisonofthegreenfluorescenceinH9c2cellsandHeLacellsinfectedwithEGFP-CVB3byflowcytometry

70% confluent H9c2 and HeLa cells were infected with RLuc-CVB3 (MOI=1). The luciferase activities were checked at intervals of 1-2 d (n=4). The infected HeLa cells were killed at the 3rd day post-infection. The luciferase activities in infected H9c2 cultures kept low at all time points tested. The Y-axis represents luciferase activity in Log.

图4RLuc-CVB3感染的H9c2细胞中RLuc表达

Fig.4ExpressionofRLucinH9c2cellsinfectedwithRLuc-CVB3

2.4 RLuc-CVB3感染后病毒核酸的RT-PCR检测

将MOI=1的RLuc-CVB3感染H9c2和HeLa细胞，以β-actin为内参，用RT-PCR方法检测H9c2细胞中RLuc-CVB3基因组RNA表达水平。结果表明，在感染后的第1、2、3、5天， H9c2细胞中可检测到病毒RNA，而在第9天和第14天却未检测到(图5)。

3 讨论

H9c2细胞是来源于胚胎期的BD1X大鼠心脏组织的亚克隆细胞系，表现很多骨骼肌细胞的特性[1]。由于来源于心脏，H9c2细胞作为心脏成肌细胞也应用于一些研究中[2,3]。

柯萨奇病毒属小核糖核酸病毒科，它是小的无包膜病毒，核酸为单股正链RNA。根据柯萨奇病毒对乳鼠致病特点的不同，将其分成A组和B组。因为在心肌炎和扩张型心肌病患者的心肌组织中经常可检测到CVB基因组，所以认为CVB是造成心肌炎和扩张型心肌病的主要病原体[7-10]。CVB感染容许细胞后，通常会产生明显的致细胞病变效应。H9c2细胞能否被CVB感染并作为体外细胞模型应用于CVB致心肌疾病的研究，目前未见报道。

70% confluent H9c2 and HeLa cells were infected with RLuc-CVB3 (MOI=1). The genomic RNA of RLuc-CVB3 in infected H9c2 cells could be detected at days 1, 2, 3, and 5, but not at days 9 and 14. The amplification length of RLuc-CVB3 is 638 bp, the amplification length of β-actin is 444 bp, and the marker is DL2000. p.i., post-infection.

图5RLuc-CVB3感染的H9c2细胞中病毒基因组的动态检测结果

Fig.5DynamicdetectionofgenomicRNAofRLuc-CVB3inH9c2cellsinfectedwithRLuc-CVB3

本研究中，我们采用携带有EGFP、RLuc的CVB3重组株EGFP-CVB3和RLuc-CVB3感染H9c2细胞，通过检测EGFP或RLuc的蛋白和核酸水平来反映CVB对 H9c2细胞的感染性。在EGFP-CVB3感染的H9c2细胞中，未检测到EGFP表达(图2、3)。RLuc-CVB3感染H9c2细胞后，每隔1～2 d检测RLuc的表达直到感染后第14天(n=4)也未见RLuc产生(图4)。对病毒感染的细胞进行RT-PCR检测，在RLuc-CVB3感染的H9c2细胞中，病毒的基因组RNA从感染后第9天消失(图5)。

根据H9c2细胞系表型的研究[3]，发现这种细胞表现的骨骼肌细胞特性多于心肌细胞特性。如当培养的H9c2细胞汇合时，可融合形成多核的肌管并对乙酰胆碱的刺激有反应，但缺少像心肌细胞一样的节律性搏动；同时生化和电生理的检测指标也表明其具有骨骼肌特性[1]。我们的研究也表明大鼠骨骼肌细胞和H9c2细胞都抵抗CVB3重组毒株的感染，为支持H9c2细胞在对CVB感染的易感性上具有大鼠骨骼肌的表型提供了进一步的证据。因此，不能以这种传代细胞系代替心肌细胞进行CVB致心肌疾病的研究。

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